| 研究課題/領域番号 |
17590195
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
生理学一般
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| 研究機関 | 生理学研究所 |
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研究代表者 |
根本 知己 生理学研究所, 脳機能計測センター, 准教授 (50291084)
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| 研究期間 (年度) |
2005 – 2006
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| 研究課題ステータス |
完了 (2006年度)
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| 配分額 *注記 |
3,500千円 (直接経費: 3,500千円)
2006年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
2005年度: 2,400千円 (直接経費: 2,400千円)
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| キーワード | 細胞生理学 / カルシウムシグナル / 2光子顕微鏡 / 分泌腺 / 高性能レーザー / 開口放出 / 生物物理学 / SNARE / 生理学 / 外分泌腺 |
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| 研究概要 |
シナプス前終末の神経分泌に代表される開口放出の過程において、融合細孔の形成にはSNAREコア複合体の形成が必須であると考えられている。しかし、この分子複合体がどのように膜融合を引き起こすのか、その作用機序は未解明である。本研究は2光子励起法を発展させ、蛍光タグ化タンパク質を発現させ、Ca2+濃度上昇、SNAREコア複合体の形成、融合細孔形成の間の時間的空間的な因果関係を、さらに明らかにすることを目的として実施した。神経分泌のモデル細胞としてPC12細胞及び副腎髄質クロマフィン細胞を用いた。まずPC12細胞に、SNAREコア複合体の構成分子である蛍光タグ化SNAP25発現系を確立し、PC12細胞に導入した。蛍光抗体染色法により、内在性のSNAP25同様に細胞膜に集積することを確認した。ケージドカルシウム試薬NP・EGTAの紫外線閃光活性化による開口放出の際生じるΩ構造と蛍光タグ化SNAP25を同時可視化する系を確立した。即ち、NP-EGTAを負荷させたPC12標本を、水溶性の近赤外蛍光化デキストランを含む細胞外液で灌流し、細胞外部空間をネガティブに染色した。その結果、逐次開口放出におけるSNAP25の膜融合した顆粒膜への側方拡散が観察された。即ち細胞深部へSNAP25が拡散し、SNARE複合体を深部分泌顆粒膜上で形成することが、効率的な分泌顆粒の分泌への動員に重要であることが推定された。また、副腎髄質クロマフィン細胞でも逐次開口放出とSNAP25の拡散を示し、さらに「バキュオール型逐次開口放出」という新規的な様式で分泌が生じていることを世界に先駆け発見した。このバキュオール型逐次開口放出では、形成されたΩ構造が拡張していく。この拡張は内容物ゲルの膨潤によることを明らかにするとともに、この膨潤が開口放出を促進している等の生理学的意義が明らかにした。
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