| 研究概要 |
これまでの研究よりチェックポイント蛋白質複合体9-1-1複合体(Rad1, Rad9, Hus1)は,細胞周期、特にS期およびG2/M期チェックポイントにおけるダメージセンサーと考えられている.9-1-1複合体のDNAダメージ依存的なリン酸化やPCNAとの構造的な類似性、またチェックポイント機構の大まかなシグナル伝達経路については報告されてきている.しかしながら,1)Rad1, Rad9, Hus1それぞれの本質的かつ固有な機能は何であるのか.2)なぜ9-1-1複合体がPCNAのようにホモ三量体ではなくヘテロ三量体でなくてはならないのか.3)9-1-1複合体のどのような働きがダメージセンサーの本態をなすのか,4)9-1-1複合体がDNA修復系や複製系、また細胞死とどの様に関わっているのかなどの点については明らかにされていない.そこで、本研究ではマウスembryonic carcinoma細胞株F9細胞を用いた遺伝子ターゲッティングにより,Rad1, Rad9, Hus1遺伝子のコンディショナルノックアウト(KO)細胞を樹立,及びRad1, Rad9, Hus1それぞれの遺伝子への変異の導入もしくは9-1-1分子間のドメインの入れ替えによる変異遺伝子のノックインにより、9-1-1蛋白質の固有な機能について明らかにすることを目的とした.Rad1遺伝子およびHus1遺伝子についてはKO細胞株を樹立し研究に用いた.Rad9遺伝子についてはKO細胞株を樹立することは出来なかったため,Rad9遺伝子に対する組換miRNAをデザインした.Rad1のKO細胞ではRad1遺伝子のノックアウトにより,細胞死が誘導されたが,Hus1のKO細胞では細胞死は観察されなかった.また,Rad1遺伝子配列中に保存されている潜在的ヌクレアーゼモチーフの点変異を作製し,野生型と共に組換タンパク質を作製し,in vitroでヌクレアーゼの活性を検索したが,有効なヌクレアーゼ活性は観察されなかった.また,Hus1は以前の報告と同様に,ユビキチン化されるが,このユビキチン化は恒常的におきており,DNAを傷害する薬剤処理によってHus1のユビキチン化が大きく影響されることは観察されなかった.
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