動物細胞ゲノムにおける単一DNA二重鎖切断誘導とその修復モニタリング技術の開発

• 研究課題/領域番号: 17590279
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 病態医化学
• 研究機関: 広島大学 (2006); 川崎医科大学 (2005)
• 研究代表者: 高田 穣 広島大学, 原爆放射線医科学研究所, 教授 (30281728)
• 研究分担者: 北尾 洋之 広島大学, 原爆放射線医科学研究所, COE研究員 (30368617)
• 研究期間 (年度): 2005 – 2006
• 研究課題ステータス: 完了 (2006年度)
• 配分額: 3,500千円 (直接経費: 3,500千円); 2006年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円); 2005年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
• キーワード: DNA連鎖切断修復 / TAT配列 / エストロジェン受容体 / DNA二重鎖切断修復 / I-SceI / estrogen receptor / tamoxifen

研究概要

高等動物培養細胞株を用いて、単一の染色体部位にDNA二重鎖切断(DSB)を誘導し、その後の修復過程をリアルタイムモニタリングするシステムを構築することを目指して検討を行った。まず、18塩基認識制限酵素I-SceIの認識配列を含んだ人工基質をあらかじめ染色体に1コピー組み込んだ細胞を作成した。I-SceIの発現導入法として、(1)18塩基認識制限酵素I-SceIに細胞内移行シグナルの11アミノ酸(TAT配列)を付加した組み換え蛋白の作成。(2)エストロジェン受容体(ER)との癒合蛋白としての発現。以上の二つの方法を試みた。前者では、培養液に添加することでの細胞内導入を、後者はタモキシフェン添加によって一気に核内に移行させることを狙った。誘導されたDSBの修復によるネオマイシン耐性化を主なリードアウトとして検討した。
(1)の結果として、I-SceI制限酵素とTAT配列との融合蛋白(TAT-I-SceI)の精製は可能であったが、沈殿化し、活性のある形での精製は我々の手では不可能であった。
(2)I-SceIとERとの融合蛋白発現は、ERをI-SceIのN末、C末にそれぞれ一つづつ付加したもの、さらにふたつのERでI-SceIをはさんだものと、3種類を試みた。DSB誘導をligation mediated PCRとネオ耐性化で確認したが、サザンプロットで検出できるレベルまでは効率は上がらなかった。人工基質部分のクロマチン構造が切断を阻害する可能性をクリアするため、同様の人工基質をもち高効率でネオ耐性化することが報告されている細胞をケンブリッジ大から共同研究で入手して検討したが、効率は同等であった。
最近、海外の二つのグループが同様の方法論を学会で報告した(キーストンミーティング、2007)。効率は我々と同レベルと思われる。タモキシフェン添加により簡便にDSBを誘導出来る細胞は確立できているので、今後この細胞の応用を検討してゆく。

研究成果

• [雑誌論文] A requirement of FancL and FancD2 monoubiquitination in DNA repair. (2007)
  • 著者名/発表者名: Seki S, Ohzeki M, etal.
  • 雑誌名: Genes Cells 12・3 ページ: 299-310
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Characterization of the short isoform of Helios overexpressed in patients with T-cell malignancies. (2007)
  • 著者名/発表者名: Tabayashi T, Ishimaru F, Takata M, etal.
  • 雑誌名: Cancer science 98・2 ページ: 182-188
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Activation of downstream epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling provides gefitinib-resistance in cells carrying EGFR mutation. (2007)
  • 著者名/発表者名: Uchida A, Hirano S, etal.
  • 雑誌名: Cancer science 98・3 ページ: 357-363
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] A requirement of FancL and FancD2 monoubiquitination in DNA repair. (2007)
  • 著者名/発表者名: Seki S, Ohzeki M, Uchida A, Hirano S, Matsushita N, Kitao H, Oda T, Yamashita T, Kashihara N, Tsubahara A, Takata M, Ishiai M.
  • 雑誌名: Genes Cells. 12(3) ページ: 299-310
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Characterization of the short isoform of Helios overexpressed in patients with T-cell malignancies. (2007)
  • 著者名/発表者名: Tabayashi T, Ishimaru F, Takata M, Kataoka I, Nakase K, Kozuka T, Tanimoto M.
  • 雑誌名: Cancer Sci. 98(2) ページ: 182-8
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Activation of downstream epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling provides gefitinib-resistance in cells carrying EGFR mutation. (2007)
  • 著者名/発表者名: Uchida A, Hirano S, Kitao H, Ogino A, Rai K, Toyooka S, Takigawa N, Tabata M, Takata M, Kiura K, Tanimoto M.
  • 雑誌名: Cancer Sci. 98(3) ページ: 357-63
  • NAID: 10019481589
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] FAAP100 is essential for activation of the Fanconi anemia-associated DNA damage response pathway. (2007)
  • 著者名/発表者名: Ling C, Ishiai M, Ali AM, Medhurst AL, Neveling K, Kalb R, Yan Z, Xue Y, Oostra AB, Auerbach AD, Hoatlin ME, Schindler D, Joenje H, de Winter JP, Takata M, Meetei AR, Wang W.
  • 雑誌名: EMBO J. [Epub ahead of print]
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] A requirement of FancL and FancD2 monoubiquitination in DNA repair. (2007)
  • 著者名/発表者名: Seki S, Ohzeki M, et al.
  • 雑誌名: Genes Cells. 12・3 ページ: 299-310
• [雑誌論文] Characterization of the short isoform of Helios overexpressed in patients with T-cell malignancies. (2007)
  • 著者名/発表者名: Tabayashi T, Ishimaru F, Takata M, et al.
  • 雑誌名: Cancer science 98・2 ページ: 182-188
• [雑誌論文] Activation of downstream epidermal rowth factor receptor (EGFR) signaling provides gefitinib-resistance in cells carrying EGFR mutation. (2007)
  • 著者名/発表者名: Uchida A, Hirano S, et al.
  • 雑誌名: Cancer science 98・3 ページ: 357-363
• [雑誌論文] Functional interplay between BRCA2/FANCD1 and FANCC in DNA repair. (2006)
  • 著者名/発表者名: Kitao H, Yamamoto K, etal.
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 281・301 ページ: 21312-21320
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] 53BP1 contributes to survival of cells irradiated with X-ray during G1 without Ku70 or Artemis. (2006)
  • 著者名/発表者名: Iwabuchi K, Hashimoto M, etal.
  • 雑誌名: Genes Cells. 11・8 ページ: 935-948
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Functional interplay between BRCA2/FANCD1 and FANCC in DNA repair. (2006)
  • 著者名/発表者名: Kitao H, Yamamoto K, Matsushita N, Ohzeki M, Ishiai M, Takata M.
  • 雑誌名: J Biol Chem. 281(30) ページ: 21312-20
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] 53BP1 contributes to survival of cells irradiated with X-ray during G1 without Ku70 or Artemis. (2006)
  • 著者名/発表者名: Iwabuchi K, Hashimoto M, Matsui T, Kurihara T, Shimizu H, Adachi N, Ishiai M, Yamamoto K, Tauchi H, Takata M, Koyama H, Date T.
  • 雑誌名: Genes Cells. 11(8) ページ: 935-48
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Functional interplay between BRCA2/FANCD1 and FANCC in DNA repair. (2006)
  • 著者名/発表者名: Kitao H, Yamamoto K, et al.
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 281・302 ページ: 21312-21320
• [雑誌論文] 53BP1 contributes to survival cells irradiated with X-ray during G1 without Ku70 or Artemis. (2006)
  • 著者名/発表者名: Iwabuchi K, Hashimoto M, et al.
  • 雑誌名: Genes Cells. 11・8 ページ: 935-948
• [雑誌論文] Role of NAD-dependent deacetylases SIRT1 and SIRT2 in radiation-and cisplatin-induced cell death in vertebrate cells. (2005)
  • 著者名/発表者名: Matsushita N, Takami Y, Kimura M, Tachiiri S, Ishiai M, Nakayama T, Takata M.
  • 雑誌名: Genes Cells. 10(4) ページ: 321-32
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] A FancD2-Monoubiquitin Fusion Reveals Hidden Functions of Fanconi Anemia Core Complex in DNA Repair. (2005)
  • 著者名/発表者名: Matsushita N, Kitao H, Ishiai M, Nagashima N, Hirano S, Okawa K, Ohta T, Yu DS, McHugh PJ, Hickson ID, Venkitaraman AR, Kurumizaka H, Takata M.
  • 雑誌名: Mol Cell. 19(6) ページ: 841-7
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Multiple repair pathways mediate tolerance to chemotherapeutic cross-linking agents in vertebrate cells. (2005)
  • 著者名/発表者名: Nojima K, Hochegger H, Saberi A, Fukushima T, Kikuchi K, Yoshimura M, Orelli BJ, Bishop DK, Hirano S, Ohzeki M, Ishiai M, Yamamoto K, Takata M, Arakawa H, Buerstedde JM, Yamazoe M, Kawamoto T, Araki K, Takahashi JA, Hashimoto N, Takeda S, Sonoda E.
  • 雑誌名: Cancer Res. 65(24) ページ: 11704-11
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Role of NAD-dependent deacetylases SIRT1 and SIRT2 in radiation- and cisplatin-induced cell death in vertebrate cells. (2005)
  • 著者名/発表者名: Nobuko Matsushita, et al.
  • 雑誌名: Genes Cells 10(4) ページ: 321-332
• [雑誌論文] FancD2-Monoubiquitin Fusion Reveals Hidden Functions of Fanconi Anemia Core Complex in DNA Repair (2005)
  • 著者名/発表者名: Matsushita N., et al.
  • 雑誌名: Mol Cell 16;19(6) ページ: 841-847
• [雑誌論文] Multiple repair pathways mediate tolerance to chemotherapeutic cross-linking agents in vertebrate cells. (2005)
  • 著者名/発表者名: Nojima K., et al.
  • 雑誌名: Cancer Res. 15;65(24) ページ: 11704-11711
• [雑誌論文] FAAP100 is essential for activation of the Fanconi anemia-associated DNA damage response pathway.
  • 著者名/発表者名: Chen Ling, Masamichi Ishiai, etal.
  • 雑誌名: The EMBO Journal (in press)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] FAAP100 is essential for activation of the Fanconi anemia-associated DNA damage response pathway.
  • 著者名/発表者名: Chen Ling, Masamichi Ishiai, et al.
  • 雑誌名: The EMBO Journal (in press)