| 研究課題/領域番号 |
17590280
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
病態医化学
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| 研究機関 | 川崎医科大学 |
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研究代表者 |
石合 正道 川崎医科大学, 医学部, 准教授 (90298844)
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| 研究期間 (年度) |
2005 – 2006
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| 研究課題ステータス |
完了 (2006年度)
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| 配分額 *注記 |
3,600千円 (直接経費: 3,600千円)
2006年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円)
2005年度: 2,200千円 (直接経費: 2,200千円)
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| キーワード | DNA修復 / ファンコニ貧血症 / 家族性乳ガン / 遺伝性疾患 / DT40 / yeast two-hybrid / 分子生物学 / 遺伝学 / がん / 生化学 |
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| 研究概要 |
高発ガン性遺伝疾患であるファンコニ貧血(FA)、家族性乳ガン(BRCA)原因遺伝子産物はどちらも相同組換えと呼ばれるDNA修復機構に関連する。FA経路とBRCA経路の機能的関連はこれまでにも多く指摘されているが、生体内での作用メカニズムは不明である。研究代表者等は、ニワトリFancD2のN末側をbaitとしたyeasttwo-hybrid(Y2H)スクリーニングにより、BCCIPというBRCA2結合タンパク質のC末側断片を単離した。そこで、BCCIPがFancD2とBRCA2の両方に結合し、FA経路とBRCA経路を直接的に結びつける可能性を考え、検討を行った。
BCCIPとFancD2の相互作用を確認するために、ニワトリBCOIPとFANCD2の全長をクローニングし、それぞれHis、TAPタグ付きタンパク質として発現するベクターを構築し、293T細胞に共発現させ、ビーズによるTAP-FancD2のプルダウンとウエスタン法によりBCCIPとFancD2の結合を確認した。
次に、ヒト遺伝子でこの分子間相互作用の普遍性を検討した。ヒトBCCIPとBRcA2の結合が報告されており(Liu等2001:Lu等2005)、全長のヒトBCCIP、FANCD2の全長並びにN末端断片、さらに結合領域を含む3つの異なるヒトBRCA2断片を用い、bait,preyの考えられる全ての組み合わせについて、Y2H法で検討を行った。BCCIP baitとBRCA2 preyで非常に弱い相互作用が検出されたものの、その他の組み合わせでは相互作用が見られなかった。
ヒトでの検出が難しいので再びニワトリ遺伝子を用い、今度はmammalian two-hybrid(M2H)法で検討した。ニワトリBCCIPとFANCD2の全長及びスクリーニングで同定された断片を用い、bait,preyの考えられる全ての組み合わせを試したが、どれも相互作用を検出できず、ニワトリBRCA2の断片を同時に共発現させても効果はなかった。BCCIPとFancD2の相互作用は非常に弱く、用いる実験系により検出の程度が異なると考えられる。
DT40細胞を用いたBCCIPのコンディショナルターゲティングは、第1アリルは順当であったが、第2アリルのターゲティングは困難であり、数100個のクローンを調べたが達成されていない。酵母の類似遺伝子BCP1は致死であり(Audhya＆Enlr2003)、DT40でもBCCIPが致死遺伝子である可能性が推測される。そこで、ヒト細胞を用い、RNA干渉法(RNAi)によるBCCIPの発現抑制(ノックダウン)を試みている。293T細胞に導入したGFP融合ヒトBCCIPの発現が抑制されることを確認したので、内在性BCCIPの発現抑制の条件を検討中である。
一方、研究代表者らはニワトリDT40細胞由来のfancc/brca2二重変異細胞を作製し、細胞増殖と細胞のX線感受性ではこの2つの経路が遺伝学的に関連することを報告した(Kitao等2006)。つまり、FA経路とBRCA経路の相互作用が生体内で確かに存在することが確認された。その相互作用領域を確定し、変異体を作製、解析することにより、BCCIP-FANCD2の相互作用の生物学的意味を探っていきたいと考えている。
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