研究課題
基盤研究(C)
分子量1,000以下のハプテン抗原をamolレベルで検出する新規の超高感度免疫測定法「ヘテロキャプチャー・サンドイツチEIA」を開発し、内分泌撹乱物質をはじめ、低分子物質の高感度検出を可能とする。そのため、ファージディスプレイ法を用い、低分子抗原と第一抗体の複合体に対する第二抗体を調製し、この2種類の抗体による超高感度非競合法を確立する。内分泌撹乱物質の生体内での影響を解析するために申請者らは、たんぱく質分解機構への影響を検討することにした。そこで、モデルハプテンとして、E-64cを用いることとした。このB-64cは、チオールプロテアーゼ阻害剤で、in vivoでリソゾーム中のカテプシンBを強く阻害するため、細胞内分解機構の解明に良く用いられているが、その代謝機構は明らかではない。本法では、E-64cとそれに対する第一抗体を反応させ、E-64c-抗体複合体を形成させ、ついで、E-64c-抗体結合部に対する特異第二抗体を結合させ測定する。そのため、特異第二抗体を「ファージディスプレイ法」により調製するが、第一抗体は、モノクローナル抗体でなければならない。そこで、まず、E-64cのモノクローナル抗体を調製することにした。E-64c-KLHをカルボジイミドにより作成、マウスに免疫し、モノクローナル抗体を調製した。このモノクローナル抗体・E-64c結合部に特異的な人工抗体をファージディスプレイ法により作成中である。これと平行して、2種類の標識抗体を用いた場合の立体障害を回避するために、抗複合体特異scFvと第一抗体抗原認識部位から最も物理的に遠いFabのC末端部に導入したシステインのSH基を用いるための、種々の標識体や酵素の標識法の検討や選別を行った。その結果、代謝回転率や分子量からリコンビナント・アルカリフォスファターゼを用い、マレイミドーヒンジ法が適していることが分かった。
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すべて 雑誌論文 (14件)
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