| 研究課題/領域番号 |
17590289
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
人類遺伝学
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| 研究機関 | 琉球大学 |
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研究代表者 |
要 匡 琉球大学, 医学部, 助教授 (40264288)
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| 研究分担者 |
成富 研二 琉球大学, 医学部, 教授 (20101446)
柳 久美子 琉球大学, 医学部, 助手 (90294701)
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| 研究期間 (年度) |
2005 – 2006
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| 研究課題ステータス |
完了 (2006年度)
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| 配分額 *注記 |
2,700千円 (直接経費: 2,700千円)
2006年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
2005年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
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| キーワード | 遺伝子 / 発現制御 / ミニ染色体 / 遺伝子治療 / DT40 / Cre / loxP / position effect |
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| 研究概要 |
<多様なミニ染色体ベクターの作製>
ミニ染色体上のテロメア側、セントロメア内、中間領域での遺伝子発現および染色体の安定性を検討するため、それぞれの領域にゲノム遺伝子(BAC)を導入できるミニ染色体を個別に作製し、検討した。ミニ染色体の改変は、DT40細胞内で行った。
1)ミニ染色体改変用プラスミドベクターの構築
ヒトX染色体由来ミニ染色体(IKNFA3)の各部位へ、相同組換えにより変異型lox71を挿入するためのプラスミドベクターを作製した。変異型lox71挿入用ベクターは、blasticidin R発現カセット(CAG lox71 bsr)を用いて作製した。また、ミニ染色体テロメア側の薬剤耐性遺伝子(neoR)をZeocinR遺伝子へ変更するためのtelomere-targeting vectorも新たに作製した。
2)ミニ染色体の改変
上記挿入用ベクターを用い、ミニ染色体の各部位へCAG lox71 bsrをそれぞれ挿入した改変ミニ染色体を作製した。同時に、テロメア側(短腕側)をZerocinR遺伝子へ変更した。
3)改変ミニ染色体へのBAC導入
上記改変ミニ染色体へ、遺伝子発現ユニットをもつBAC(HPRT-66, F9-66)をCre/変異lox系を用いて導入した。導入効率は、約70〜75%であった。
<BAC導入ミニ染色体における遺伝子発現と安定性>
改変ミニ染色体のテロメア側、セントロメア側、中間領域のそれぞれの領域に挿入されたBAC内遺伝子(HPRT)の発現について検討した。定量PCRによる発現比較では、テロメア側にBACを挿入したクローンのヒトHPRT遺伝子発現を100とすると、セントロメア側挿入クローンでは83、中間領域挿入クローンでは122であった。細胞核あたりのコピー数は、1コピー(約70%)または2コピー(約30%)がほとんどであった。また、内在性Hprt遺伝子発現量に対し、ヒトHPRT遺伝子発現量は約15%であった。これは、宿主細胞の種の違いによると考えられた。長期培養による遺伝子発現は、テロメア側、中間領域挿入クローンで大きな変化はなかった。
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