| 研究課題/領域番号 |
17590340
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
実験病理学
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
村雲 芳樹 名古屋大学, 大学院医学系研究科, 助教授 (40324438)
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| 研究分担者 |
川井 久美 名古屋大学, 医学部附属病院, 助手 (50362231)
時々輪 真由美 名古屋大学, 大学院医学系研究科, 助手 (50378006)
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| 研究期間 (年度) |
2005 – 2006
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| 研究課題ステータス |
完了 (2006年度)
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| 配分額 *注記 |
3,500千円 (直接経費: 3,500千円)
2006年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
2005年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
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| キーワード | 損傷トレランス / REV7 / DNA修復 / 損傷乗り越え型DNA複製 / ノックアウトマウス / DNA損傷 / 損傷乗り換え型DNA複製 |
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| 研究概要 |
本研究ではREV7遺伝子のノックアウトベクターの作成と、ES細胞への導入、相同組み換え体の同定のためのスクリーニングを行った。REV7蛋白は、中央部に種々の蛋白との結合領域があるので、その領域を欠失させた変異マウスを作成することとし、その領域をコードしているエクソン3から6までをneo耐性遺伝子に置き換えたノックアウトベクターを作成した。Negative選択マーカーとしてジフテリア毒素を用いた。作成したノックアウトベクターをマウスES細胞に導入し、G418耐性クローンを約150個pick upした。そしてゲノムDNAを抽出して、PCR法にて相同組み換え体の同定を行った。しかし、pick upしたcloneの中に相同組み換え体を同定することができなかった。そのため、ノックアウトベクターを構築するプラスミドを変更し、同じ領域をターゲットとして新たにノックアウトベクターを構築した。そのベクターをマウスES細胞に導入し、G418耐性クローンを約750個pick upし、ゲノムDNAを抽出して相同組み換え体の同定をPCRにて行った。しかし、反応条件を様々に変えて検討するも組み換え体は同定できず、さらに、ラジオアイソトープを用いたサザン法にてPCR産物を確認してみたが、陽性クローンは同定できなかった。今回、相同組み換え体が同定できなかった原因として、1)相同組み換えが起こりにくい部位であった、2)PCRによるスクリーニングの方法に問題があった、等が考えられた。そのため、相同組み換え部位を変更し、マウスREV7 locusのエクソン1から6までを欠損させるノックアウトベクターを新たに構築した。スクリーニングにはサザン法を用いるように制限酵素部位を考慮して設計した。今後、このノックアウトベクターを再度ES細胞に導入し、相同組み換え体を同定してノックアウトマウスの解析を進めたいと考えている。
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