転写因子過給機構を備えた遺伝子発現システムの開発とDNAワクチンへの応用

• 研究課題/領域番号: 17590425
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: ウイルス学
• 研究機関: 横浜市立大学
• 研究代表者: 佐々木 津 横浜市立大学, 医学部・客員準教授 (40342901)
• 研究分担者: 武下 文彦 横浜市立大学, 医学部, 準教授 (60333572)
• 研究期間 (年度): 2005 – 2006
• 研究課題ステータス: 完了 (2006年度)
• 配分額: 3,500千円 (直接経費: 3,500千円); 2006年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円); 2005年度: 2,400千円 (直接経費: 2,400千円)
• キーワード: DNAワクチン / 転写因子 / 遺伝子発現

研究概要

CMVプロモーター内に転写因子結合モチーフ(NF-κB、AP-1、C/EBP、CIITA、IRF、ISRE)をタンデムに5-7個連結した配列を挿入した。これらをプラスミドDNAに組み込み、下流にレポーター遺伝子(Luc、SEAP、LacZ)を挿入した。対応する転写因子の発現プラスミドを作製(NF-κB、c-Fos、c-Jun、C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPγ、C/EBPδ、C/EBPε、CIITA、IRF3、IRF7)した。レポータープラスミドと転写因子発現プラスミドを組み合わせて細胞にトランスフェクトし、レポーターアッセイを行い、良好な組み合わせを検討した。HEK293細胞においては、どの組み合わせも野生型CMVプロモーターと比べ強力にレポーター遺伝子の発現を増強した。筋肉細胞株C2C12ではAP-1結合モチーフを7個x3(AAA)組み込んだCMVプロモーターとc-Fos/c-Jun発現プラスミドの組み合わせが強力にレポーター遺伝子の発現を増強した。肝細胞株Hepa1.6ではC/EBP結合モチーフを5個x3(CCC)組み込んだCMVプロモーターとC/EBPδプラスミドの組み合わせが強力にレポーター遺伝子の発現を増強した。実際に、生体内に筋注エレクトロポレーション法を用いてプラスミドを導入した場合にどの組み合わせが免疫原性増強に有効であるか検討するため、二重プロモーターベクター(抗原遺伝子と転写因子遺伝子を共発現させるベクター)を構築してマウスに投与した。AP-1結合モチーフを挿入したCMVプロモーターによる標的遺伝子発現カセットと、AP-1を共発現させることで、ヒトSEAP遺伝子の長期持続発現(6ヶ月以上)が確認された。また、ISREを挿入したCMVプロモーターは、従来型CMVプロモーターと比べて、強い免疫原性が得られた。これらのことからさまざまな転写因子結合モチーフを挿入したCMVプロモーターを用いることで、標的遺伝子産物に対する免疫原性を調節することが可能であることが示唆された。

研究成果

• [雑誌論文] Suppression of iodide uptake and thyroid hormone synthesis with stimulation of the type I interferon system by double-stranded RNA (dsRNA) in cultured human thyroid follicles. (2007)
  • 著者名/発表者名: Yamazaki K, Suzuki K, Yamada E, Yamada T, Takeshita F, Matsumoto M, Mitsuhashi T, Obara T, Takano K, Sato K
  • 雑誌名: Endocrinology (in press)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Muscle creatine kinase/SV 40 hybrid promoter for muscle-targeted long-term transgene expression (2007)
  • 著者名/発表者名: Takeshita F, Takase K, Tozuka M, Saha S, Okuda K, Ishii N, Sasaki S
  • 雑誌名: Int. J. Mol. Med. 19 ページ: 309-315
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Blocking of the TLR5 activation domain hampers protective potential of DNA vaccine targeting flagellin. (2007)
  • 著者名/発表者名: Saha S, Takeshita F, Matsuda T, Jounai N, Kobiyama K, Matsumoto T, Sasaki S, Yoshida A, Xin KQ, Klinman DM, Uematsu S, Ishii KJ, Akira S, Okuda K.
  • 雑誌名: J.Immunol. (in press)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] TLR9 expression and function is abolished by the cervical cancer-associated human papillomavirus type 16. (2007)
  • 著者名/発表者名: Hasan UA, Bates E, Takeshita F, Biliato A, Accardi R, Bouvard V, Mansour M, Vincent I, Gissmann L, Iftner T, Sideri M, Stubenrauch F, Tommasino M.
  • 雑誌名: J.Immunol. 178 ページ: 3186-3197
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Suppression of iodide (2007)
  • 著者名/発表者名: Yamazaki K, Suzuki K, Yamada E, Yamada T, Takeshita F, Matsumoto M, Mitsuhashi T, Obara T, Takano K, Sato K.
  • 雑誌名: Endocrinology (in press)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Muscle creatine kinase/SV 40 hybrid promoter for muscle-targeted long-term transgene expression. (2007)
  • 著者名/発表者名: Takeshita F, Takase K, Tozuka M, Saha S, Okuda K, Ishii N, Sasaki S.
  • 雑誌名: Int.J.Mol.Med. 19 ページ: 309-315
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Suppression of iodide uptade and thyroid hormone synthesis with stimulation of the type I interferon system by double-stranded RNA (dsRNA) in cultured human thyroid follicles. (2007)
  • 著者名/発表者名: Yamazaki K, Suzuki K, Yamada E, Yamada T, Takeshita F, Matsumoto M, Mitsuhashi T, Obara T, Takano K, Sato K
  • 雑誌名: Endocrinology (in press)
• [雑誌論文] A fused gene of nucleoprotein (NP) and herpes simplex virus genes (VP22) induces highly protective immunity against different subtypes of influenza virus (2006)
  • 著者名/発表者名: Saha S, Yoshida S, Ohba K, Matsui K, Matsuda T, Takeshita F, Umeda K, Tamura Y, Okuda K, Klinman D, Xin KQ, Okuda K
  • 雑誌名: Virology 35 ページ: 48-57
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Multivalent DNA vaccine protects mice against pulmonary infection caused by Pseudomonas aeruginosa (2006)
  • 著者名/発表者名: Saha S, Takeshita F, Sasaki S, Matsuda T, Tanaka T, Tozuka M, Takase K, Matsumoto T, Okuda K, Ishii N, Yamaguchi K, Xin KQ, Klinman DM, Okuda K
  • 雑誌名: Vaccine 24 ページ: 6240-6249
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Activator protein 1-mediated transcriptional regulation strategy sustains long-term expression of a xenogeneic gene product in vivo : An implication for gene therapy targeting congenital protein deficiencies (2006)
  • 著者名/発表者名: Sasaki S, Smith JM, Takase K, Okuda K, Ishii N, Takeshita F
  • 雑誌名: Int. J. Mol. Med. 18 ページ: 289-297
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] TLR-adaptor molecules enhance DNA-raised adaptive immune responses against flu and tumor challenge through the activation of innate immunity (2006)
  • 著者名/発表者名: Takeshita F, Tanaka T, Matsuda T, Tozuka M, Kobiyama K, Saha S, Matsui K, Ishii KJ, Coban C, Akira S, Ishii N, Suzuki K, Klinman DM, Okuda K, Sasaki S
  • 雑誌名: J. Virol 80 ページ: 6218-6224
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] A fused gene of nucleoprotein (NP) and herpes simplex virus genes (VP22) induces highly protective immunity against different subtypes of influenza virus. (2006)
  • 著者名/発表者名: Saha S, Yoshida S, Ohba K, Matsui K, Matsuda T, Takeshita F, Umeda K, Tamura Y, Okuda K, Klinman D, Xin KQ, Okuda K.
  • 雑誌名: Virology 35 ページ: 48-57
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Multivalent DNA vaccine protects mice against pulmonary infection caused by Pseudomonas aeruginosa. (2006)
  • 著者名/発表者名: Saha S, Takeshita F, Sasaki S, Matsuda T, Tanaka T, Tozuka M, Takase K, Matsumoto T, Okuda K, Ishii N, Yamaguchi K, Xin KQ, Klinman DM, Okuda K.
  • 雑誌名: Vaccine 24 ページ: 6240-6249
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Activator protein 1-mediated transcriptional regulation strategy sustains long-term expression of a xenogeneic gene product in vivo : An implication for gene therapy targeting congenital protein deficiencies. (2006)
  • 著者名/発表者名: Sasaki S, Smith JM, Takase K, Okuda K, Ishii N, Takeshita F.
  • 雑誌名: Int.J.Mol.Med. 18 ページ: 289-297
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] TLR-adaptor molecules enhance DNA-raised adaptive immune responses against flu and tumor challenge through the activation of innate immunity. (2006)
  • 著者名/発表者名: Takeshita F, Tanaka T, Matsuda T, Tozuka M, Kobiyama K, Saha S, Matsui K, Ishii KJ, Coban C, Akira S, Ishii N, Suzuki K, Klinman DM, Okuda K, Sasaki S.
  • 雑誌名: J.Virol. 80 ページ: 6218-6224
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Double stranded B-DNA activates type-I IFNs gene program via IPS-1/TBK1 pathway. (2006)
  • 著者名/発表者名: Ishii KJ, Coban C, Kato H, Takahashi K, Torii Y, Takeshita F, Ludwig H, Sutter G, Suzuki K, Hemmi H, Sato S, Tamamoto M, Uematsu S, Kawai T, Takeuchi 0, Akira S.
  • 雑誌名: Nat.Immunol. 7 ページ: 40-48
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Double stranded B-DNA activates type-I IFNs gene program via IPS-1/TBK1 pathway (2006)
  • 著者名/発表者名: Ishii KJ
  • 雑誌名: Nat.Immunol. 7 ページ: 40-40
• [雑誌論文] Hyperproduction of IFN-g by CpG Oligodeoxynucleotide-iduced exacerbation of atopic dermatitis-like skin lesion in some NC/Nga mice. J. (2005)
  • 著者名/発表者名: Takakura M, Takeshita F, Aihara M, Xin K-Q, Ichino M, Okuda K, Ikezawa Z
  • 雑誌名: J.Invest.Dermatol. 125 ページ: 1156-1162
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Prime-boost vaccination with plasmid DNA and a chimeric adenovirus type 5 vector with type 35 fiber induces protective immunity against HIV. (2005)
  • 著者名/発表者名: Xin K-Q, Jounai N, Someya K, Honma K, Mizuguchi H, Naganawa S, Kitamura K, Hayakawa T, Saha S, Takeshita F, Okuda K, Honda M, Klinman DM, Okuda K.
  • 雑誌名: Gene Ther. 12 ページ: 1769-1777
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] TRAF4 acts as a silencer in TLR-mediated signaling through the association with TRAF6 and TRIF. Eur. (2005)
  • 著者名/発表者名: Takeshita F, Ishii KJ, Kobiyama K, Kojima Y, Coban C, Sasaki S, Ishii N, Klinman DM, Okuda K, Akira S, Suzuki K.
  • 雑誌名: J.Immunol. 35 ページ: 2477-85
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Comparison of antigen-specific cellular immune responses between individual PBMCs and splenocytes. (2005)
  • 著者名/発表者名: Xin K-Q, Ohta S, Jounai N, Takeshita F, Okuda K.
  • 雑誌名: Vaccine 23 ページ: 2954-2955
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Identification of novel single stranded RNA that stimulates human CD14+ CD11c+ monocytes. (2005)
  • 著者名/発表者名: Sugiyama T, Gursel M, Takeshita F, Conover J, Akira S, Klinman DM, Ishii KJ. CpG RNA
  • 雑誌名: J.Immunol. 174 ページ: 2273-2279
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] TRAF4 acts as a silencer in TLR-mediated signaling through the association with TRAF6 and TRIF. (2005)
  • 著者名/発表者名: Takeshita F
  • 雑誌名: Eur.J.Immunol. 35 ページ: 2477-2477
• [雑誌論文] Hyperproduction of IFN-γ by CpG Oligodeoxynucleotide-iduced exacerbation of atopic dermatitis-like skin lesion in some NC/Nga mice (2005)
  • 著者名/発表者名: Takakura M
  • 雑誌名: J.Invest.Dermatol 125 ページ: 1156-1156
• [雑誌論文] Interleukin-1 receptor-associated kinase-1 plays an essential role for Toll-like receptor (TLR)7- and TLR9-mediated interferon-alpha induction (2005)
  • 著者名/発表者名: Uematsu S
  • 雑誌名: J.Exp.Med. 201 ページ: 915-915
• [雑誌論文] CpG RNA : Identification of novel single stranded RNA that stimulates human CD14+ CD11c+ monocytes (2005)
  • 著者名/発表者名: Sugiyama T
  • 雑誌名: J.Immunol. 174 ページ: 2273-2273
• [雑誌論文] DNAワクチンの可能性 (2005)
  • 著者名/発表者名: 武下文彦
  • 雑誌名: 臨床と微生物 32 ページ: 275-275
  • NAID: 10015687427
• [雑誌論文] Interleukin-1 receptor-associated kinase-1 plays an essential role for Toll-like receptor (TLR)7-and TLR9-mediated interferon-alpha induction.
  • 著者名/発表者名: Uematsu S, Sato S, Yamamoto M, Hirotani T, Kato H, Takeshita F, Matsuda M, Coban C, Ishii KJ, Kawai T, Takeuchi 0, Akira S.
  • 雑誌名: J.Exp.Med. 201 ページ: 915-923
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [産業財産権] 内因性自然免疫活性化分子を利用した遺伝子アジュバント (2005)
  • 発明者名: 武下文彦
  • 権利者名: 横浜市立大学
  • 出願年月日: 2005-08-25
• [産業財産権] 緑膿菌に対して感染防御能を誘導できる医薬組成物 (2004)
  • 発明者名: 武下文彦
  • 権利者名: 横浜市立大学
  • 出願年月日: 2004-11-28
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より