| 研究課題/領域番号 |
17590439
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
免疫学
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| 研究機関 | 佐賀大学 |
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研究代表者 |
木本 雅夫 佐賀大学, 医学部, 教授 (40153225)
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| 研究分担者 |
福留 健司 佐賀大学, 医学部, 助教授 (50284625)
常吉 直子 佐賀大学, 医学部, 助手 (80336114)
渡邊 啓一 (渡邉 啓一) 佐賀大学, 農学部, 教授 (40191754)
本島 浩之 佐賀大学, 農学部, 助手 (20312275)
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| 研究期間 (年度) |
2005 – 2006
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| 研究課題ステータス |
完了 (2006年度)
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| 配分額 *注記 |
3,600千円 (直接経費: 3,600千円)
2006年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円)
2005年度: 2,200千円 (直接経費: 2,200千円)
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| キーワード | MD-2 / LPS / pET32ベクター / 融合蛋白 / 大腸菌発現系 / NFκBレポーター遺伝子 / エピトープ / pCAGG-S1ベクター / pCAG-S1ベクター |
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| 研究概要 |
1.MD-2とLPSの結合様式の機能的解析
MD-2分子の配列で、陰性荷電のアミノ酸が存在する領域がLPSとの結合に重要であることが推測されており、それらの位置にあるアミノ酸をアラニン置換し、トランスフェクタント細胞に発現させた。LPSとの結合をMD-2に付加したタグを利用した免疫沈降法により解析したところ、これらの位置のアミノ酸がLPSとの結合に影響を及ぼしていることを確認した。
2.大腸菌発現リコンビナント蛋白の作製・精製
pET32ベクターを用いて種々のMD-2蛋白変異体とthioredoxinとの融合蛋白を作製した。これらをカラムクロマトグラフィーにより精製した。大腸菌発現系においては、発現してきた融合蛋白が、発現に用いた大腸菌由来のLPSと結合した形で精製されてくる。この結合は、種々の界面活性剤に感受性を有することが明らかになった。
3.LPS結合の機能的解析
変異MD-2発現BaF3細胞をLPSで刺激し、NFκBレポーター遺伝子を指標に活性化を測定し、MD-2分子のどの領域、およびどのアミノ酸がLPS認識に必要かを解析した。この系に、種々のMD-2分子の異なったエピトープを認識するmAbを加え、LPS刺激阻害や、結合阻害の有無を解析し、これらの抗体が認識するエピトープの相互関係を明らかにした。
4.MD-2分子の立体構造解析
大腸菌発現系を用いたリコンビナント蛋白を精製したが、結晶作製の条件を満たさなかった。哺乳類細胞培養によるリコンビナント蛋白の作製をpCAGG-S1ベクターを用いる実験系を用いて発現させたが、発現量が少なく、立体構造解析の資料とならない。今後は、昆虫細胞での発現を試みる。
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