炎症関連転写因子活性化測定法開発による全身性炎症反応症候群の病態迅速診断

• 研究課題/領域番号: 17590486
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 病態検査学
• 研究機関: 富山大学
• 研究代表者: 北島 勲 富山大学, 大学院医学薬学研究部, 教授 (50214797)
• 研究分担者: 岸 裕幸 富山大学, 大学院医学薬学研究部, 助教授 (60186210) ; 安岡 彰 長崎大学, 医学部, 教授 (80242113)
• 研究期間 (年度): 2005 – 2006
• 研究課題ステータス: 完了 (2006年度)
• 配分額: 3,500千円 (直接経費: 3,500千円); 2006年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円); 2005年度: 2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
• キーワード: 全身性炎症反応症候群 / 炎症性サイトカイン / 迅速検査 / 転写因子 / NF-κB / 敗血症 / ELISA / SPR / 1分子計測

研究概要

本研究は、NF-κBを中心とした炎症関連転写因子を病院検査室で測定できる技術を開発することにより、炎症性サイトカイン産生亢進状態を網羅的に予測できるシステムを構築することにより、致死率の極めて高い全身性炎症反応症候群(SIRS)の発症を予測することが到達目標である。2年間の研究成果の概略を以下に示す。
1)炎症性サイトカイン異常産生とNF-κB活性化亢進の関連:マウスマクロファージにグラム陰性菌体成分LPSを添加するとその受容体であるTLR4からシグナルが伝わりNF-κB活性化を介して、グラム陽性菌体成分PGの受容体であるTLR2発現が誘導される。この結果はグラム陽性・陰性菌複合感染にNF-κB活性化が関与することを示している。
2)NF-κB定量測定用ELISA開発:NF-κB結合コンセンサス配列を有する結合特異性の最も高いプローブを作成した。3末をビオチン化しマイクロプレート上に固着した。本プレート上に核蛋白を添加しNF-κBp50またはp65抗体と反応後発色反応にて定量化した。リコンビナント蛋白を用い本ELISA法では6.25ngまで測定可能であった。
3)NF-κB定量測定用ELISAシステムによるNF-κB活性化とIL-6経時解析:ヒト末梢血単核球にPHA/PMAを刺激すると、刺激30分で核内NF-κBp50が上昇(OD値が0.3から1.6)、しかしIL-6産生はこの時点では確認できなかった。しかし、刺激4時間でIL-6産生上昇(OD値が30分で0.12から4時間で0.41)が確認され、NF-κB活性化がIL-6産生に先行することを確認した。
4)NF-κB定量測定用ELISAシステムによる健常者リンパ球核内NF-κB量の基準範囲設定:インフォームドコンセントが得られた健常者(28人)リンパ球核蛋白で測定した。その結果p50ELISAで3名が0.01ng/μgで残り25名は0.005ng/μg以下の測定限界以下、p65ELISAでは28名全例がOD値0.1以下の測定限界を示し、健常人はほとんど核内へNF-κBが移行していないことが推定できた。
5)表面プラズモン法(SPR)を利用した高感度測定法の特異性検討:健常者の核内NF-κB量がELISA測定限度以下の0.01ng/核蛋白(μg)以下に存在することより、さらに高感度化を実現するためSPR法応用を検討した。HeLa細胞にTNF激した核蛋白で検討した結果、0.001ng/μgまでシグナルが得られたが、NF-κBとのプローブ競合反応試験にて、非特異的反応が強く,高感度に伴う特異性低下が課題となった。
以上、臨床検査領域で炎症性サイトカイン産生を予測するための転写因子NF-κB活性化測定には、0.001ng/μg以下まで直線性を示す高感度測定系とその特異性が保障される新しい測定技術導入開発をすすめる必要があることが明らかとなり、現在、新しい1分子計測法を用いた測定法を検討中である。

研究成果

• [雑誌論文] SAD : a novel presynaptic kinase associated wuth synaptic vesicle and the active zone cytomatrix that regulates neurotransmitter release. (2006)
  • 著者名/発表者名: Inoue E, Mochida S, Takagi H, Higa S, Kitajima I, Ohtsuka T, Takai Y
  • 雑誌名: Neuron 50・2 ページ: 261-275
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Anti-inflammatory effects pitavastatin on NF-κB activation by TNF-α in hepatocellular carcinoma cells (2006)
  • 著者名/発表者名: Wang J, Tokoro T, Higa S, Kitajima I
  • 雑誌名: Biol. Pharm. Bull. 24・4 ページ: 634-639
  • NAID: 110005602161
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] PEA3 cooperates with c-Jun in regulation of HER2/neu transcription. (2006)
  • 著者名/発表者名: Matsui K, Sugimori K, Motomura H, Ejiri N, Tsukada K, Kitajima I
  • 雑誌名: Oncology Reports 16・1 ページ: 153-158
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] CLASPs attach microtube pluse ends to cell cortex through a complex with LL5β. (2006)
  • 著者名/発表者名: Lansbergen G, Grigoriev I, Ohtsuka T, Higa S, Kitajima I, Demmers J, et al.
  • 雑誌名: Dev. Cell 11 ページ: 21-32
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] The active zone protein CAST is a component of conventional and ribbon synapses in mouse retina. (2006)
  • 著者名/発表者名: Deguchi-Tawarada M, Inoue E, Takao-Rikitsu E, Unoue M, Kitajima I Ohtsuka, T, Takai Y
  • 雑誌名: J.Comp.Neurol. 495(4) ページ: 480-496
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Anti-inflammatory Effect of Pitavastatin on NF-κB Activated by TNF-α in Hepatocellular Carcinoma Cells. (2006)
  • 著者名/発表者名: Wang J, Tokoro T, Higa S, Kitajima I
  • 雑誌名: Biol.Pharm.Bull. 24(4) ページ: 634-639
  • NAID: 110005602161
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] PEA3 cooperates with c-Jun in regulation of HER2/neu transcription. (2006)
  • 著者名/発表者名: Matsui K, Sugimori K, Motomura H, Ejiri N, Tsukada K, Kitajima I
  • 雑誌名: Oncology Reports. 16(1) ページ: 153-158
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] CLASPs attach microtube plus ends to the cell cortex through a complex with LL5β (2006)
  • 著者名/発表者名: Lansbergen, G., Grigoriev, I., Mimori-Kiyosue, Y., Ohtsuka, T., Higa, S., Kitajima, I., Demmers, J., Galjart, N., Houtsmuller, A.B., Grosveld, F., Akhmanova, A.
  • 雑誌名: Dev.Cell. 11 ページ: 21-32
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] SAD : a novel presynaptic kinase associated with synaptic vesicles and the active zone cytomatrix that regulates neurotransmitter release. (2006)
  • 著者名/発表者名: Inoue E, Mochida S, Takagi H, Higa S Deguchi-Tawarada M, Unoue M, Yao I, Takeuchi K, Kitajima I, Setou M, Ohtsuka T, Takai Y
  • 雑誌名: Neuron 50(2) ページ: 261-275
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] SAD : novel presynaptic kinase associated wuth synaptic vesicle and the active zone cytomatrix that regulates neurotransmitter release. (2006)
  • 著者名/発表者名: Inoue E, Mochida S, Takagi H, Higa S, Kitajima I, Ohtsuka T, Takai Y
  • 雑誌名: Neuron 50・2 ページ: 261-275
• [雑誌論文] The active zone protein CAST is a component of conventional and ribbon synapses in mouse retina. (2006)
  • 著者名/発表者名: Deguchi-Tawarada M, Inoue E, Takao-RIkitsu E, Kitajima I
  • 雑誌名: J. Comp. Neurol. 495・4 ページ: 480-496
• [雑誌論文] The effects of eicosapentaenoic acid-fortified food on inflammatory markers in healthy subjects-A randomized, placebo-controlled, double-blind study. (2006)
  • 著者名/発表者名: Fujioka S, Hamazaki K, Itoyama M, Huan M, Nishizawa H, Kitajima I, et al.
  • 雑誌名: J. Nurtr. Sci. Vitaminol. 52 ページ: 261-265
  • NAID: 110004789054
• [雑誌論文] Pitavastatin at low dose activates endothelial nitric oxide synthetase through PI3K-Akt pathway in endothelial cells (2005)
  • 著者名/発表者名: Wang J, Tokoro T, Matsui K, Higa S, Kitajima I
  • 雑誌名: Life Sciences 76(19) ページ: 2257-2268
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] BMP2 prevents apoptosis of N1511 chodrocytic cells through P13K/Akt-mediated NF-κB activation (2005)
  • 著者名/発表者名: Sugimori K, Matsui K, Motomura H, Tokoro T, Wang J, Kitajima I
  • 雑誌名: J. Bone Miner Metab 23(6) ページ: 411-419
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Pitavastatin at low dose activates endothelial nitric oxide synthase through PI3K-Aht pathway in endothelial cells (2005)
  • 著者名/発表者名: Wang J, Tokoro T, Matsui K, Higa S, Kitajima I
  • 雑誌名: Life Siences 76(19) ページ: 2257-2268
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] BMP2 prevents apoptosis of N1511 chodrocytic cells through PI3K/Akt-mediated NF-κB activation. (2005)
  • 著者名/発表者名: Sugimori K, Matsui K, Motomura H, Tokoro T, Wang J, Kimura T, Kitajima I
  • 雑誌名: J.Bone Miner.Metab. 23 ページ: 411-419
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] The effect c apoptosis signal-regulating kinase 1 gene transfer on rat collagen induced arthritis (2005)
  • 著者名/発表者名: Terauchi R, Arai Y, Takahashi KA, Inoue A Tonomura H, Asada H, Kishida T, Imanishi j, Mazda O, Kitajima I, Kubo T
  • 雑誌名: J.Rheumatol 32(12) ページ: 2373-2380
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Mutation study of antithrombin the role of disulfide bonds in the intracellular accumulation and formation of Russell body-like structures. (2005)
  • 著者名/発表者名: Tanaka Y., Ueda K., Ozawa T., Kitajima I., Okamura S., Morita M., Yokota S., Imanaka T.
  • 雑誌名: J.Biochem 137(3) ページ: 273-285
  • NAID: 10017343620
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Identification of a novel aminoacid deletion mutation and a very rare single nucleotide variant in a Japanese family with type antithrombin deficiency. (2005)
  • 著者名/発表者名: Takayama K, Hashimoto N, Tanaka Y, Ozawa T, Emi Y, Ikeda T, Katayama M, Nomura S Kitajima I, Nakano T, Imanaka T
  • 雑誌名: Thromb.Res 116 ページ: 215-221
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] BMP2 prevents apoptosis of N1511 chocrocytic cells through PI3K/Akt-mediated NF-κB activation (2005)
  • 著者名/発表者名: Sugimori K, Matsui K, Motomura H, Tokoro T, Wang J, Kitajima I
  • 雑誌名: J.Bone Miner Metab 23(6) ページ: 411-419
• [雑誌論文] Pitavastatin at low dose activates endothelial nitric oxide synthetase through PI3K-Akt pathway in endothelial cells. (2005)
  • 著者名/発表者名: Wang J, Tokoro T, Matsui K, Higa S, Kitajima I
  • 雑誌名: Life Sciences 76(19) ページ: 2257-2268
• [雑誌論文] The effect of apoptosis signal-regulating kinase 1 gene transfer on rat collageninduced arthritis. (2005)
  • 著者名/発表者名: Terauchi R, Arai Y, Takahashi KA, Inoue A, Tonomura H, Asada H, Kitajima I, Kubo T
  • 雑誌名: J Rheumatol 32(12) ページ: 2373-2380
• [雑誌論文] Identification of a novel aminoacid deletion mutation and very rare single nucleotide variant in a Japanese family with type I antithrombin deficiency. (2005)
  • 著者名/発表者名: Takayama K, Hashimoto N, Tanaka Y, Ozawa T, Emi Y, Ikeda T, Kitajima I, Imanaka T
  • 雑誌名: Thromb.Res 116 ページ: 215-221
• [雑誌論文] Single-cell microarray for analyzing cellular response (2005)
  • 著者名/発表者名: Yamamura S, Kishi H, Kondo S, Honda R, Rao SR, Omori M, Tamiya E, Muraguchi A
  • 雑誌名: Anal Chem 77(24) ページ: 8050-8056
• [雑誌論文] Generalized tetanus with intractable automonic cardiovascular instability in aged woman (2005)
  • 著者名/発表者名: Nakamura M, Maruyama M, Yasuoka A, Funada H, Kobayashi M
  • 雑誌名: Kansenshogaku Zasshi 79(8) ページ: 556-560
• [図書] 流れがわかる実践検査マニュアル上・下巻 (2006)
  • 著者名/発表者名: 北島 勲
  • 総ページ数: 730
  • 出版者: メデイカルレビュー社(東京)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [図書] SIRSの臨床検査:転写因子による病態解析 医学のあゆみ:血液疾患-state of arts (2005)
  • 著者名/発表者名: 北島 勲(坂田洋一, 小澤哲也 編)
  • 総ページ数: 798
  • 出版者: 医歯薬出版株式会社