| 研究課題/領域番号 |
17591946
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
機能系基礎歯科学
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| 研究機関 | 北海道医療大学 |
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研究代表者 |
東城 庸介 北海道医療大学, 歯学部, 教授 (90111731)
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| 研究分担者 |
谷村 明彦 北海道医療大学, 歯学部, 准教授 (70217149)
森田 貴雄 北海道医療大学, 歯学部, 助教 (20326549)
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| 研究期間 (年度) |
2005 – 2006
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| 研究課題ステータス |
完了 (2006年度)
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| 配分額 *注記 |
3,500千円 (直接経費: 3,500千円)
2006年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
2005年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
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| キーワード | 唾液腺 / カルシウムイオン / イノシトール三リン酸 / カルシウムシグナル / 蛍光イメージング / GFP / FRET / LIBRA |
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| 研究概要 |
1.唾液腺導管細胞のカルシウム応答を可視化し、アゴニストに対する感受性を調べた。その結果、導管細胞には低濃度のアゴニストに反応する高感受性細胞が存在することが明らかになった。また、低濃度のフェニレフリン、カルバコール、ATPはそれぞれ異なる細胞を活性化することがわかった。
2.唾液腺細胞のIP_3動態を調べるため、IP_3分子センサーLIBRAの改変を試みた。蛍光アクセプターであるYFPをVenusに置換し、pHに安定なLIBRAを作成した。さらに、CFPとIP_3結合部位をつなぐ部分、およびVenusとIP_3結合部位をつなぐ部分の最適化を行った。また、VenusおよびCFPを、それぞれ円順列変異体に置換した。
3.改変したLIBRAを培養細胞に発現させ、サポニン処理後IP_3刺激による蛍光変化を測定した。その結果、改変したLIBRAでは約40%の蛍光変化率の増加が認められた。
4.ラット耳下腺腺房細胞の初代培養を試みた。酵素処理によって単離耳下腺細胞を調製し、DMEM-F12培養液で培養した。培養6時間までは単離直後と同様の形態的極性を有していた。培養2日目では多くの細胞は極性を失っていたが、正常な形態を保持した細胞も少数みられた。カルシウム応答を測定したところ、2日目の細胞でもアゴニストに十分反応することがわかった。
5.耳下腺初代培養細胞にGFPおよびPKC-GFP遺伝子の細胞内導入を試みた。遺伝子導入にはレポフェクトアミン2000とOpti MEM培養液を用いる方法が最も効果的であった。イオノマイシン刺激によりPKC-GFPが細胞膜にトランスローケーションすることが示された。
6.唾液腺培養細胞に改変LIBRAを発現させ、アゴニスト刺激によるIP_3産生をモニターした。IP_3とCa^<2+>の同時測光を行い、その相関性を調べた。
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