生物時計装置作動の可視化

• 研究課題/領域番号: 17657063
• 研究種目: 萌芽研究
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 細胞生物学
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 石浦 正寛 名古屋大学, 遺伝子実験施設, 教授 (20132730)
• 研究分担者: 井原 邦夫 名古屋大学, 遺伝子実験施設, 助手 (90223297)
• 研究期間 (年度): 2005
• 研究課題ステータス: 完了 (2005年度)
• 配分額: 3,600千円 (直接経費: 3,600千円); 2005年度: 3,600千円 (直接経費: 3,600千円)
• キーワード: ナノバイオ / 分子モーター / 酵素反応 / 時計タンパク質 / タンパク質間相互作用 / X線結晶構造解析 / 原子構造 / 藍色細菌

研究概要

藍色細菌の生物時計分子装置は3つの時計タンパク質KaiA、KaiB、KaiCから構成され、これまでにKaiA(我々による)とKaiCの原子構造がX線結晶構造解析により解明されている。我々は、別府温泉産の好熱性藍色細菌Thermosynechococcus elongatusにおいて遺伝子移入系を確立し、生物発光リズム系を開発、さらに時計タンパク質と時計関連タンパク質の大腸菌における大量生産法と高度精製法を確立し、これらタンパク質の生化学的解析とX線結晶構造解析を進めてきた。
本実験計画では、未解明であったT.elongatus KaiBの結晶構造を解明した(Iwase et al.,2005,J.Biol.Chem.280:43141-43149)。KaiBは他のタンパク質との相同性も既知のモチーフも見つかっておらず、構造機能相関の推測が困難でした。我々はX線結晶構造解析により分解能2.6ÅでKaiBの4量体6角板状構造を解明し、その原子構造に基づき時計機能に重要なアミノ酸残基と「サブ構造」を実験的に同定した。in vivoリズム解析により、サブ構造である負電荷に富んだ2列の尾根状構造(negative ridges)とその間に存在する正電荷に富んだ溝状構造(positive cleft)が、時計発振に重要なことを明らかにした。KaiBサブユニット構造は新規フォールドであり、KaiBにおける構造機能相関の解明は世界初である。次にKaiA-KaiC聞の相互作用を一分子計測で解析するため、KaiC6量体をガラス基板に固定し、蛍光色素で修飾したKaiAを貫流して、相互作用を解析した。現在のところ、KaiAの非特異的吸着のノイズが高すぎて特異的なシグナルを検出するに至っていない。KaiAの非特異的吸着の軽減策の検討や溶液系での一分子計測系の立ち上げを試みつつある。

研究成果

• [雑誌論文] Real-time monitoring of the circadian gene expression in the chloroplast. (2006)
  • 著者名/発表者名: Matsuo, T., Onai, K., Okamoto, K., Minagawa, J., Ishiura, M.
  • 雑誌名: Mol.Cell.Biol. 26 ページ: 863-870
• [雑誌論文] Functionally important substructures of circadian clock protein KaiB in unique tetramer complex. (2005)
  • 著者名/発表者名: Iwase, R., Imada, K., Hayashi, F., Uzumaki, T., Morishita, M., Onai, K., Furukawa, Y., Namba, K., Ishiura, M.
  • 雑誌名: J.Bio.Chem. 280 ページ: 43141-43149
• [雑誌論文] PHYTOCLOCK1 encoding a novel GARP protein essential for the Arabidopsis circadain clock. (2005)
  • 著者名/発表者名: Onai K, Ishiura M.
  • 雑誌名: Genes Cells. 10 ページ: 963-972
• [雑誌論文] A portable integrated automatic apparatus for the real-time monitoring of bioluminescence in plants. (2005)
  • 著者名/発表者名: Okamoto, K., Onai, K., Furusawa, T., Ishiura, M.
  • 雑誌名: Plant Cell Environ. 28 ページ: 1305-1315
• [雑誌論文] Transcriptional regulation of the circadian clock operon kaiBC by upstream regions in cyanobacteria. (2005)
  • 著者名/発表者名: Kutsuna S, Nakahira Y, Katayama M, Ishiura M, Kondo T.
  • 雑誌名: Mol.Microbiol. 57 ページ: 1474-1484
• [雑誌論文] Identification of novel clock-regulated genes by cDNA macroarray analysis in Chlamydomonas reinhardtii. (2005)
  • 著者名/発表者名: Kucho, K., Okamoto, K., Tabata, S., Fukuzawa, H., Ishiura, M.
  • 雑誌名: Plant Mol.Biol. 57 ページ: 889-906
• [雑誌論文] An automated apparatus for the real-time monitoring of bioluminescence in plants. (2005)
  • 著者名/発表者名: Okamoto, K., Onai, K., Ezaki, N., Ofuchi, T., Ishiura, M.
  • 雑誌名: Anal.Biochem. 340 ページ: 187-192
• [雑誌論文] RAP, an integrated program for monitoring bioluminescence and analyzing circadian rhythms in real time. (2005)
  • 著者名/発表者名: Okamoto, K., Onai, K., Ishiura, M.
  • 雑誌名: Anal.Biochem. 340 ページ: 193-200