| 研究課題/領域番号 |
17659041
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| 研究種目 |
萌芽研究
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
医療系薬学
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
寺崎 哲也 東北大学, 未来科学技術共同研究センター, 教授 (60155463)
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| 研究分担者 |
大槻 純男 東北大学, 大学院・薬学研究科, 助教授 (60323036)
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| 研究期間 (年度) |
2005
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| 研究課題ステータス |
完了 (2005年度)
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| 配分額 *注記 |
3,200千円 (直接経費: 3,200千円)
2005年度: 3,200千円 (直接経費: 3,200千円)
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| キーワード | トランスポーター / 蛍光消光法 / 薬物分布 / ABCトランスポーター / 基質認識 / MRP4 / MIANS / High Throughput Screenint |
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| 研究概要 |
MRP4の基質認識特性を解明するために、立体構造感受性蛍光色素を用いた基質とトランスポーターの相互作用検出系の構築を行った。ヒトcDNAライブラリーからヒトMRP4の全長の単離し、MIANSを導入するための変異の導入に成功した。変異体MRP4を大量発現している膜画分を得るために、作成した変異体MRP4遺伝子をヒト胎児腎臓細胞(HEK293細胞)に導入し、安定発現株を作成した。膜小胞を作成し、変異体の活性をATPase活性とFACSを用いた蓄積度から解析した結果、変異体は野生型と同様の基質認識性を有していることが明らかになった。膜小胞の溶液にMIANSを添加し反応させ、反応液をゲルろ過カラムに通し、90%以上の膜小胞を回収し、未反応MIANSを除去することに成功した。MIANSを反応させた改変ABCC4を含む膜小胞溶液にヒトABCC4基質を順次濃度を上昇し添加し、各添加時の蛍光強度を測定した結果、基質濃度に従って蛍光光度の低下が認められた。複数の基質を用いて蛍光を計測し、濃度に対して蛍光減少率のグラフを作成した結果、基質認識に飽和性が認められることを確認した。さらに、親和性を示すKm値は、膜小胞を用いた輸送実験で報告されているKm値と非常に近い値となった。この結果は、MIANSを反応させた変異型ヒトABCC4を含む膜小胞溶液を用いることによって、ヒトABCC4の基質親和性を測定が可能であることを示している。本技術は、基質とトランスポーターの相互作用を簡便に測定できる系として、非常に重要な基盤技術である。
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