| 研究課題/領域番号 |
17659111
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| 研究種目 |
萌芽研究
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
実験病理学
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
福重 真一 東北大学, 大学院医学系研究科, 助教授 (90192723)
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| 研究期間 (年度) |
2005 – 2006
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| 研究課題ステータス |
完了 (2006年度)
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| 配分額 *注記 |
2,800千円 (直接経費: 2,800千円)
2006年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
2005年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
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| キーワード | 発現制御 / 遺伝子 / 部位特異的組換え / Cre / RNA干渉 |
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| 研究概要 |
本研究ではCre-lox遺伝子挿入系を用い、ゲノム上の特定部位(前もって導入したlox部位)に二本鎖のsiRNAを発現するコンストラクトを正確に単一コピー挿入することによって、確実にRNA干渉をおこなう細胞株の作製を目的とした。
本年度は、Ltk-細胞に単一コピーのlox位を含む細胞株、73-14を用い、マウスRet finger protein (RFP)に対するRNA干渉コンストラクトをCre-lox遺伝子挿入系により導入したステーブル細胞株を作製し、その効果を解析した。まず、73-14にRFPのRNA干渉コンストラクトを含むloxターゲティングベクターとCre発現プラスミドをトランスフェクションし、G418での薬剤選択により14個の組換え体を得た。これらの組換え体からゲノムDNAを抽出し、種々のPCRで組換え部位、RNA干渉コンストラクトの存在を確認した。次に、ネオマイシン耐性遺伝子をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションをおこない、14クローンすべてがゲノム中のlox部位に正確にRFPのRNA干渉コンストラクトをもつことを確認した。さらに、ターゲティングベクター中のCMVプロモーターをプローブとしサザンハイブリダイゼーションをおこない、14クローン中、11クローンが単一コピーの組換え体であり、残り3クローンは2コピー以上の組換え体であることが判明した。
ウエスタンブロティング法により14クローンのRFP干渉による蛋白レベルでの変化を解析した結果、どのクローンでも親株に比べ約50%のノックダウンが観察された。興味深いことにRNA干渉コンストラクトを2コピー以上もつ3個の組換え体でも単一コピーをもつ残り11個の組換え体とノックダウン率に大きな違いが見出せなかった。このことは、コピー数よりもRNA干渉を引き起こすshRNAの塩基配列を変える方がより効果的にRNA干渉をおこなえる可能性を示すと考えられる。
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