百日咳菌の特異的なヒト感染性を規定する因子の検索

• 研究課題/領域番号: 17659130
• 研究種目: 萌芽研究
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 細菌学(含真菌学)
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 堀口 安彦 大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (00183939)
• 研究分担者: 三宅 眞実 大阪大学, 微生物病研究所, 講師 (10251175) ; 神谷 重樹 大阪大学, 微生物病研究所, 助手 (60379089)
• 研究期間 (年度): 2005 – 2006
• 研究課題ステータス: 完了 (2006年度)
• 配分額: 3,300千円 (直接経費: 3,300千円); 2006年度: 2,000千円 (直接経費: 2,000千円); 2005年度: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円)
• キーワード: 百日咳菌 / Creリコンビナーゼ / In vivo expression technology (IVET) / In vivo expression technology(IVET)

研究概要

Bordetella属細菌を用いて、in vivo expression technology (IVET)を導入することが本研究課題の当初の目的である。そこで、細菌感染時に転写活性の上昇するプロモーターをクローニングするために遺伝子組み換え誘発タンパクCreの上流に気管支敗血症菌(Bordetella bronchiseptia)の染色体DNA断片を挿入したライブラリーを作製し、一方でCreの標的配列であるloxPに挟まれたレポーター遺伝子を含むターゲティングベクターを作製することを試みた。しかし、大腸菌を使用して構築したプラスミドベクターをBordetella属細菌に導入する際の効率がきわめて悪いことがわかった。そこで、電気穿孔法と接合法の二つの方法を用いて、Bordetella属細菌が持つDNT遺伝子を相同組換えによって欠失させることをモデル実験として、Bordetella属細菌へのプラスミドベクターの導入方法をあらためて検討した。その結果、電気穿孔法よりも接合法が遺伝子導入の効率がはるかに高いことがわかった。また、大腸菌に比べてBordetella属細菌の増殖速度はきわめて遅いため、あらかじめ対数増殖期に調製したBordetella属細菌を接合に用いるのがもっとも効率のよい遺伝子導入方法であることがわかった。このような予備実験の結果、ようやく、Bordetella属細菌への遺伝子導入の基礎条件が判明し、実際に相同組換えによるDNT遺伝子の欠失変異体の百日咳菌(Bordetella pertussis)を作製することが出来た。この結果を基礎に、将来的にIVET法をBordetella属細菌に応用する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Enteropathogenic Escherichia coli, Shigella flexneri, and Listeria monocytogenes recruit a junctional protein, zonula occludens-1, to actin tails and pedestals. (2007)
  • 著者名/発表者名: Hanajima-Ozawa M., et al.
  • 雑誌名: Infect. Immun. 75(2) ページ: 565-573
• [雑誌論文] Role of Tyr306 in the C-terminal fragment of Clostridium perfringens enterotoxin for modulation of tight junction. (2007)
  • 著者名/発表者名: Ebihara C., et al.
  • 雑誌名: Biochem. Pharmacol. 73(6) ページ: 824-830
• [雑誌論文] Role of tyrosine residues in modulation of claudin-4 by the C-terminal fragment of Clostridium perfringens enterotoxin. (2007)
  • 著者名/発表者名: Harada M., et al.
  • 雑誌名: Biochem. Pharmacol. 73(2) ページ: 206-214
• [雑誌論文] Crystallization and preliminary crystallographic studies of the Pasteurella multocida toxin catalytic domain. (2006)
  • 著者名/発表者名: Miyazawa M., et al.
  • 雑誌名: Acta Crystallograph Sect F Struct Biol Cryst Commun. 62 ページ: 906-908
• [雑誌論文] Preparation of a claudin-targeting molecule using a C-terminal fragment of Clostridium perfringens enterotoxin. (2006)
  • 著者名/発表者名: Ebihara, C. et al.
  • 雑誌名: J.Pharmacol.Esp.Ther. 316・1 ページ: 255-260
• [雑誌論文] Binding. of intimin with Tir on the bacterial surface is prerequisite for the barrier disruption induced by enteropathogenic Escherichia coli. (2005)
  • 著者名/発表者名: Miyake, M. et al.
  • 雑誌名: Biochem.Biophys.Res.Commun. 337・3 ページ: 922-927
• [雑誌論文] Role of C-terminal regions of the C-terminal fragment of Clostridium perfringens enterotoxin in its interaction with claudin-4. (2005)
  • 著者名/発表者名: Takahashi, A. et al.
  • 雑誌名: J.Control.Release. 108・1 ページ: 56-62
• [雑誌論文] Role of N-terminal amino acids in the absorption-enhancing effects of the C-terminal fragment of Clostridium perfringens enterotosin. (2005)
  • 著者名/発表者名: Masuyama, A. et al.
  • 雑誌名: J.Pharmacol.Exp.Ther. 314・2 ページ: 789-795
• [雑誌論文] Crystal structures reveal a thiolprotease-like catalytic triad in the C-Terminal region of Pasteurella multocida toxin.
  • 著者名/発表者名: Kitadokoro K., et al.
  • 雑誌名: Proc. Natl. Acad. Sci. USA (in press)