酵母を用いたインフルエンザウイルスゲノム複製・転写系の確立と宿主因子の探索

• 研究課題/領域番号: 17659133
• 研究種目: 萌芽研究
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: ウイルス学
• 研究機関: 筑波大学
• 研究代表者: 永田 恭介 筑波大学, 大学院人間総合科学研究科, 教授 (40180492)
• 研究期間 (年度): 2005 – 2006
• 研究課題ステータス: 完了 (2006年度)
• 配分額: 3,300千円 (直接経費: 3,300千円); 2006年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円); 2005年度: 1,900千円 (直接経費: 1,900千円)
• キーワード: インフルエンザウイルス / 酵母 / 逆遺伝学 / 宿主因子 / 複製 / 転写 / RNP複合体 / GFP

研究概要

本研究の目的は、動物細胞を宿主とするインフルエンザウイルスのゲノムの複製とウイルス遺伝子の転写を酵母細胞の中で行わせる系を確立し、ついで遺伝学的な手法を用いてこれらの過程に関与する宿主因子を同定しようというものである。酵母では全ゲノム配列が決定されており、ウイルスRNA合成に関連した変異体の相補試験で因子を簡便に同定できる。相同性を基盤に、同定された因子の動物細胞オルソログの機能解析を行なう。
精製ウイルス粒子より調製したvRNP(ウイルスゲノム-タンパク質複合体)を培養細胞に導入することにより、ウイルスゲノムの複製・転写が起きる。我々は酵母でも同様に導入されたv即Pからウイルスゲノムの複製・転写が起きることを見いだした。ウイルスRNA合成を促進する既知の宿主因子RAF-2p48の酵母ホモログであるSUB2の欠損酵母では、vRNPからのウイルスRNA合成量が低下していた。すなわち、酵母内ウイルスゲノム複製・転写系で宿主因子の探索および機能解析が可能であると考えられた。そこで、Yeast single-gene deletion libraryを用いてそれぞれの遺伝子欠損酵母に個別にvRNPをトランスフェクションし、ウイルスRNA合成活性に影響を及ぼす酵母遺伝子の探索を行なった。その結果、スプライシング関連因子の複数の欠損株においてウイルスRNA合成活性の低下が観察された。その中で最もRNA合成活性に影響を与える因子であったCUS2に注目し詳細な解析を行なった。CUS2のヒトホモログはTat-SF1であり、Tat-SF1ノックダウン細胞でウイルスRNA合成量の低下が観察された。さらにTat-SF1の過剰発現細胞株ではウイルスRNA合成活性が促進されていたことから、Tat-SF1がウイルスゲノムの複製・転写に促進的に機能する宿主因子であることが示唆された。
本研究により、酵母内ウイルスゲノム複製・転写系が確立され、網羅的な宿主因子スクリーニングが可能となり、さらにウイルスゲノム複製・転写メカニズムの解明が大きく進展するもの期待される。

研究成果

• [雑誌論文] Involvement of Hsp90 in assembly and nuclear import of the influenza virus RNA polymerase subunits. (2007)
  • 著者名/発表者名: Naito, T., Momose, F., Kawaguchi A., Nagata, K.
  • 雑誌名: Journal of Virology 81 ページ: 1339-1349
• [雑誌論文] The C protein of wild-type measles virus has the ability to shuttle between the nucleus and the cytoplasm. (2007)
  • 著者名/発表者名: Nishie, T., Nagata, K., Takeuchi, K.
  • 雑誌名: Microbes and Infection 9 ページ: 344-354
• [雑誌論文] Association of functional influenza viral proteins and RNAs with nuclear chromatin and sub-chromatin structure. (2006)
  • 著者名/発表者名: Takizawa, N., Watanabe, K, Nouno, K., Kobayashi, N., Nagata, K.
  • 雑誌名: Microbes and Infection 8 ページ: 823-833
• [雑誌論文] Stimulus- and domain-dependent cell death acceleratio by an IFN-inducible protein, human MxA. (2006)
  • 著者名/発表者名: Numajiri, A., Mibayashi, M., Nagata, K.
  • 雑誌名: Journal of Inferferon and Cytokine Research 26 ページ: 214-219
• [雑誌論文] Identification of Hsc70 as an influenza virus matrix protein (M1) binding factor involved in the virus life cycle. (2006)
  • 著者名/発表者名: Watanabe, K., Fuse, T., Asano, I., Tsukahara, F., Maru, Y., Nagata, K., Kitazato, K., Kobayashi, N.
  • 雑誌名: FEBS Letters 580 ページ: 5785-5790
• [雑誌論文] Chitosan-DNA nanoparticles : The effect of cell type and hydrolysis of chitosan on in vitro DNA transfection. (2006)
  • 著者名/発表者名: Turan, K., Nagata, K.
  • 雑誌名: Pharmceutical Development and Technology 11 ページ: 503-512
• [雑誌論文] Association of functional influenza viral proteins and RNAs with nuclear chromatin and sub-chromatin structure. (2006)
  • 著者名/発表者名: Takizawa N, Watanabe K, Nouno K, Kobayashi N, Nagata K
  • 雑誌名: Microbes and Infection (In press)
• [雑誌論文] Stimulus- and domain-dependent cell death acceleration by an IFN-inducible protein, human MxA. (2006)
  • 著者名/発表者名: Numajiri A, Mibayashi M, Nagata K
  • 雑誌名: Journal of interferon and Cytokine Research (In press)
• [雑誌論文] Involvement of Influenza Virus PA Subunit in Assemby of Functional RNA Polymerase Complexes. (2005)
  • 著者名/発表者名: Kawaguchi A, Naito T, Nagata K
  • 雑誌名: Journal of Virology 79 ページ: 732-744
• [雑誌論文] Stringent requirement of the C protein of wild-type measles virus for growth both in vitro and in macaque. (2005)
  • 著者名/発表者名: Takeuchi K, Takeda M, Miyajima N, Ami T, Nagata N, Suzaki Y, Shahnewaz J, Kadota S, Nagata K
  • 雑誌名: Journal of Virology 79 ページ: 7838-7844
• [雑誌論文] Enhancing of measles virus infection by Magnetofection. (2005)
  • 著者名/発表者名: Kadota S, Kanayama T, Miyajima N, Takeuchi K, Nagata K
  • 雑誌名: Journal of Virological Method 128 ページ: 61-66
• [雑誌論文] Serum-dependent expression of promyelocytic leukemia protein suppresses propagation of influenza virus. (2005)
  • 著者名/発表者名: Iki S, Yokota S, Okabayashi T, Yokosawa N, Nagata K, Fujii N
  • 雑誌名: Virology 343 ページ: 106-115
• [産業財産権] 酵母を用いたインフルエンザウイルスゲノムの複製・転写系 (2005)
  • 発明者名: 永田恭介, 内藤忠相
  • 権利者名: 筑波大学
  • 産業財産権番号: 2005-334549
  • 出願年月日: 2005-11-18