膜タンパク質の高効率立体構造解析をめざした発現系作成から結晶化までのシステム構築

• 研究課題/領域番号: 17681026
• 研究種目: 若手研究(A)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 生物分子科学
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 永田 宏次 東京大学, 大学院農学生命科学研究, 助教授 (30280788)
• 研究期間 (年度): 2005 – 2006
• 研究課題ステータス: 完了 (2006年度)
• 配分額: 30,550千円 (直接経費: 23,500千円、間接経費: 7,050千円); 2006年度: 10,270千円 (直接経費: 7,900千円、間接経費: 2,370千円); 2005年度: 20,280千円 (直接経費: 15,600千円、間接経費: 4,680千円)
• キーワード: membrane protein / Thermus thermophilus / Aeropyrum pernix / high-throughput expression / structural genomics

研究概要

平成18年度は、平成17年度に引き続き原核生物の膜タンパク質を大腸菌を宿主として発現させる系について検討する一方で、新たに真核生物の膜タンパク質を酵母を宿主として発現させる系について検討した。原核生物の膜タンパク質については、好熱細菌Thermus thermophilusと好熱古細菌Aeropyrum pernix岳の膜タンパク質、各53個、計106個について、pBAD(araBADプロモーター、Invitrogen)とpET-Mistic(T7プロモーター、枯草菌Bacillus subtilis由来の4回膜貫通型膜タンパク質Mistic(Roosild et al.,2005)との融合タンパク質発現ベクター、Novagen製品を改変)とに組み込むことを計画したが、一部の膜タンパク質遺伝子のベクターへの導入に難航し、結局pBADベクターに27個の膜タンパク質遺伝子を組み込み、その発現確認実験を行った。その結果、Flagタグ抗体を用いたWestern blotで、27個のうち15個の膜タンパク質について発現が確認された。特に、複数の輸送体膜タンパク質の発現量が非常に高いことが示され、結晶化用試料の調製が可能になった。真核生物の膜タンパク質については、ヒト、カイコガ、線虫、シロイヌナズナ、酵母の膜タンパク質、約50個を対象とした。膜タンパク質発現量の確認を効率のよく行うため、[α-mating factorのシグナル配列]-[膜タンパク質]-[GFP]を酵母S.cerevisiaeで発現させるベクターを構築した。現在、上記真核生物の膜タンパク質の発現確認を進めている。

研究成果

• [雑誌論文] Solution structure and binding specificity of FBPII/HYPA WW domain as Group-II/III. (2006)
  • 著者名/発表者名: Kato, Y., Hino, Y., Nagata, K., Tanokura, M.
  • 雑誌名: Proteins 63 ページ: 227-234
• [雑誌論文] Crystallization and preliminary X-ray analysis of the C-terminal RNase III domain of human Dicer. (2006)
  • 著者名/発表者名: Takeshita, D., Zenno, S., Lee, W.C., Nagata, K., Saigo, K., Tanokura, M.
  • 雑誌名: Acta Crystallogr. F62 ページ: 402-404
• [雑誌論文] Crystal structures of the short-chain flavin reductase HpaC from Sulfolobus tokodaii strain 7 in its three states [NAD (P)^+-free, NAD^+-bound, and NADP^+-bound]. (2006)
  • 著者名/発表者名: Okai, M., Kudo, N., Lee, W.C., Kamo, M., Nagata K., Tanokura, M.
  • 雑誌名: Biochemistry 45 ページ: 5103-5110
• [雑誌論文] Crystallization and preliminary X-ray analysis of CTP : phosphoethanolamine cytidylyltransferase (ECT) from Saccharomyces cerevlslae. (2006)
  • 著者名/発表者名: Ohtsuta J., Nagata, K., Lee, W.C., Ono, Y., Fukuda, R., Ohta, A., Tanokura, M.
  • 雑誌名: Acta Crystallogr. F62 ページ: 1003-1005
• [雑誌論文] Crystallization and preliminary X-ray analysis of human S100A13. (2006)
  • 著者名/発表者名: Imai F.L., Nagata, K., Yonezawa, N., Yu, J., Ito, E., Kanai, S., Tanokura, M., Nakano.M.
  • 雑誌名: Acta Crystallogr. F62 ページ: 1144-1146
• [雑誌論文] Siamycin attenuates fsr quorum sensing mediated by gelatinase biosynthesis-activating pheromone in Enterococcus faecalis. (2006)
  • 著者名/発表者名: Nakayama, J., Tanaka, E., Kariyama, R., Nagata, K.(5名), Sonomoto, K.
  • 雑誌名: J.Bacteriol. 189 ページ: 1358-1365
• [雑誌論文] Crystal Structure Of the YjgF/YER057c/UK114 Family protein from the hyperthermophilic archaeon Sulfolobus tokodaii strain 7. (2006)
  • 著者名/発表者名: Miyakawa, T., (5名), Nagata, K., Tanokura, M.
  • 雑誌名: Proteins 62 ページ: 557-561
• [雑誌論文] Crystallization and preliminary X-ray analysis of PHI566, a putative ribosomal RNA processing factor from the hyperthermophilic archacon Pyrococcus horikoshii OT3. (2006)
  • 著者名/発表者名: Jia, M.Z., Ohtsuka, J., Lee, W.C., Nagata, K., Tanokura, M.
  • 雑誌名: Acta Crystallographica Section F : Structural Biology and Crystallization Communications 62 ページ: 47-48
• [雑誌論文] Crystal structure of monomeric sarcosine oxidase from Bacillus sp. NS-129 revcals multiple conformations at the active-site loop. (2005)
  • 著者名/発表者名: Nagata, K et al.(計11名)
  • 雑誌名: Proceedings of the Japan Academy, Ser.B 81 ページ: 220-224
• [雑誌論文] Crystal structure of the short-chain flavin reductase HpaC from Sulfolobus tokodaii strain 7. (2005)
  • 著者名/発表者名: Okai, M., Kudo, N., Nagata, K., Lee, W.C., Kamo, M., Tanokura, M.
  • 雑誌名: Proceedings of the Japan Academy, Ser.B 81 ページ: 229-232
  • NAID: 130000093802
• [雑誌論文] Crystallization and preliminary X-ray analysis of the YjgF/YER057c/UK114-family protein ST0811 from Sulfolobus tokodaii strain7. (2005)
  • 著者名/発表者名: Miyakawa, T.(5名), Nagata, K., Tanokura, M.
  • 雑誌名: Acta Crystallographica Section F : Structural Biology and Crystallization Communications 61 ページ: 828-830
• [雑誌論文] Crystal structure of glutamine amidotransferase from Pyrococcus horikoshii OT3. (2005)
  • 著者名/発表者名: Maruoka, S., Lee, W.C., Kamo, M., Kudo, N., Nagata, K., Tanokura, M.
  • 雑誌名: Proceedings of the Japan Academy, Ser.B 81 ページ: 459-462
  • NAID: 130000093819