大規模RNAiライブラリーを用いたカルシウム流入分子機構の網羅的探索

研究課題

研究課題/領域番号	17689011
研究種目	若手研究(A)
配分区分	補助金
研究分野	薬理学一般
研究機関	名古屋大学
研究代表者	廣瀬謙造名古屋大学, 大学院医学系研究科, 教授 (00292730)
研究期間 (年度)	2005 – 2006
研究課題ステータス	完了 (2006年度)
配分額 *注記	30,680千円 (直接経費: 23,600千円、間接経費: 7,080千円) 2006年度: 6,500千円 (直接経費: 5,000千円、間接経費: 1,500千円) 2005年度: 24,180千円 (直接経費: 18,600千円、間接経費: 5,580千円)
キーワード	カルシウム / カルシウムストア / ゲノム / RNAi / siRNA
研究概要	本研究においては、転写産物を網羅する大規模なRNAiライブラリーからカルシウム流入機構をノックダウンするsiRNA配列を取得し、カルシウム流入機構を担う分子の探索を行うことを目的としている。昨年度までに、RNAiライブラリー構築法の改良とモデル系を用いたセレクション法を確立している。また、カルシウム濃度上昇によって選別する方法が確立された。これらの技術基盤をもとに、本年度は、カルシウム濃度上昇を抑制するsiRNA配列の取得を試みた。Jurkat細胞由来のcDNAライブラリーから作製されたRNAiライブラリーをJurkat細胞に導入した後、カルシウム蛍光指示薬であるfluo4を負荷した。セルソーターを用いfluo4の蛍光強度を指標にして、カルシウム濃度上昇を阻害するsiRNAを保有する細胞の分離を行なった。カルシウム濃度上昇を惹起する薬物としては小胞体のSERCA阻害薬であるタプシガルジンを用いた。ほとんどの細胞においては、カルシウム濃度上昇が阻害されていないが、カルシウム濃度上昇が相対的に低い細胞を選別した。これら選別された細胞からPCR法によってsiRNA配列をコードするカセットを増幅して回収し、再びベクターに挿入することによって2次ライブラリーを構築した。ライブラリーを再びJurkat細胞に導入して同様の選別を行い、カルシウム濃度上昇を阻害するsiRNA配列の濃縮を目指した。数回の選別を通じて、ライブラリーの導入後にカルシウム濃度上昇が阻害されている細胞が増加していることが明らかとなった。この濃縮ライブラリーから個別のクローンを分離し、カルシウム濃座上昇抑制効果を調べたところ有意な抑制効果を持つsiRNA配列を取得することができた。