| 研究課題/領域番号 |
17700347
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
神経化学・神経薬理学
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
増田 章男 名古屋大学, 大学院医学系研究科, 助手 (10343203)
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| 研究期間 (年度) |
2005 – 2006
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| 研究課題ステータス |
完了 (2006年度)
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| 配分額 *注記 |
3,600千円 (直接経費: 3,600千円)
2006年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円)
2005年度: 2,200千円 (直接経費: 2,200千円)
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| キーワード | スプライシング / PTBP1 / HnRNP-H / 筋無力症 / AChR / MS2 / 遺伝子 / RNA / 神経科学 |
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| 研究概要 |
AChRのαサブユニットをコードする遺伝子CHRNA1上のinframe exonであるP3Aのalternative splicingを制御する因子の同定および機能解析を行った。
P3Aのalternative splicingを生じるαIVS3-8G→A mutationを解析した。
変異配列とその前後15merを含んだoligo DNA(計31mer)およびその対象として同一部位の正常配列より、in vitro transcription法によりBiotin標識したUTPを取り込ませながらprobe RNAを合成した。HEK293細胞より抽出した核タンパクとprobeを混合し、probeと核タンパクを結合させた。このRNA/蛋白複合体をstreptavidineビーズにより精製し、結合蛋白をWestern blotting法により同定したところ、probeには、スプライシング制御因子であるPTBP1とHnRNP-Hが結合することが判明した。特に、HnRNP-Hは変異配列で結合が著明に減弱していた。
次に、HnRNP-Hと特定の配列RNAに結合することが知られているMS2coat proteinの融合タンパク(MS2-HnRNP-H)発現プラスミドを作成した。変異部位にMS2結合配列を挿入したminigeneを作成し、Hela細胞にMS2-HnRNP-H発現プラスミドと共にtransfectionした。RNAを回収し、P3Aのスプライスパターンの変化を確認したところ、MS2-HnRNP-H発現によりP3A exon inclusionが著明に減少した。
以上により、αIVS3-8G→Amutationは、HnRNP-H結合部位を破壊し、HnRNP-Hが機能しなくなるため、alternativesplicingを引き起こすことが判明した。
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