生細胞中での蛋白質の部位特異的蛍光標識法の開発

• 研究課題/領域番号: 17750162
• 研究種目: 若手研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 生体関連化学
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 大槻 高史 岡山大学, 大学院自然科学研究科, 講師 (80321735)
• 研究期間 (年度): 2005 – 2006
• 研究課題ステータス: 完了 (2006年度)
• 配分額: 3,600千円 (直接経費: 3,600千円); 2006年度: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円); 2005年度: 2,300千円 (直接経費: 2,300千円)
• キーワード: 蛍光アミノ酸 / 蛋白質 / 翻訳 / 哺乳動物細胞 / 非天然アミノ酸 / tRNA / EF-Tu / プロテオーム / 蛋白質生合成 / コドン / 細胞 / 直交化tRNA / 蛍光標識

研究概要

細胞内の生体分子の動態や局在などのネットワークを調べることはポストゲノム時代の最重要課題の1つである。この課題を網羅的・効率的に進めるためには、生体分子を可視化させる蛍光標識技術の開発が必要である。蛋白質分子の蛍光標識法としては、目的蛋白質の末端にGFPなど蛍光蛋白質を結合させる方法が現在一般的であるが、大きな蛍光蛋白質を融合することにより目的蛋白質の本来の性質が損なわれる可能性も高い。そこで、蛋白質の機能に極力影響を与えない小さな蛍光基の導入が望まれる。本課題では、細胞内で蛋白質中の望んだ部位に蛍光基を導入する方法を開発することを試みた。本方法は細胞内の蛋白質合成装置を利用し、蛍光基をもつアミノ酸を直交化tRNAに結合させ、mRNA上のコドン特異的に蛋白質に導入するというものである。この方法では、蛍光部位は小さな蛍光基としてアミノ酸一残基分のスペースに導入するため、蛋白質の機能を損なう可能性は少ない。
本年度は、細胞内翻訳装置により蛍光アミノ酸を蛋白質に組み込む方法を検討した。蛍光アミノ酸に対応するコドンとしてアンバーコドンを用い、アンバーコドンを含む蛋白質遺伝子(ここではDsRed遺伝子)を発現ベクターに組み込んで、哺乳動物細胞(ここではCHO細胞)に導入した。その細胞に細胞内のARSによりアミノアシル化されるようなサプレッサーtRNAをリポフェクション法により導入したところ、DsRedの赤色蛍光によりアンバーコドンのサプレッションが観測された。細胞外で蛍光アミノ酸(Bodipy-FL-AF)を結合させたサプレッサーtRNAを用いた場合も、アミノアシルtRNAのエンドソーム経由での細胞内導入が確認された。主にエンドソーム内にアミノアシルtRNAが固まって強い蛍光を放っていたため、これを改善するような導入法を今後さらに検討する。

研究成果

• [雑誌論文] T-armless tRNAs and elongated elongation factor Tu. (2007)
  • 著者名/発表者名: Ohtsuki, T., Watanabe, Y.
  • 雑誌名: IUBMB life (in press)
• [雑誌論文] Design of carrier tRNAs and selection of four-base codons for efficient incorporation of various nonnatural amino acids into proteins in Spodoptera frugiperda 21 (Sf21)insect cell-free translation system (2006)
  • 著者名/発表者名: Taki, M., Tokuda, Y., Ohtsuki, T., Sisido, M.
  • 雑誌名: J.Biosci.Bioeng. 102 ページ: 511-517
  • NAID: 110006196944
• [雑誌論文] An evolutionary `intermediate state' of mitochondrial translation systems found in Trichinella species of parasitic nematodes : co-evolution of tRNA and EF-Tu. (2006)
  • 著者名/発表者名: Arita, M., Suematsu, T., Osanai, A., Inaba, T., Kamiya, H., Kita, K., Sisido, M., Watanabe.Y., Ohtsuki, T.
  • 雑誌名: Nucleic Acids Research 34 ページ: 5291-5299
• [雑誌論文] A protein extension to shorten RNA : Elongated elongation factor Tu recognizes the D-arm of T-armless tRNAs in nematode mitochondria. (2006)
  • 著者名/発表者名: Sakurai, M., Watanabe, Y., Watanabe, K., Ohtsuki, T.
  • 雑誌名: Biochemical Journal 399 ページ: 249-256
• [雑誌論文] Identification of the residues involved in the unique serine specificity of C.elgans mitochondrial EF-Tu2. (2006)
  • 著者名/発表者名: Sato, A., Watanabe, Y., Suzuki, T., Komiyama, M., Watanabe, K., Ohtsuki, T.
  • 雑誌名: Biochemistry 45 ページ: 10920-10927
• [雑誌論文] 非天然アミノ酸の導入による蛋白質の蛍光ラベル法とその応用 (2006)
  • 著者名/発表者名: 宍戸昌彦, 瀧真清, 大槻高史, 芳坂貴弘
  • 雑誌名: 蛋白質核酸酵素 51・5 ページ: 399-407
  • NAID: 40007273470
• [雑誌論文] Binding efficiency of EF-Tu to tRNAs charged with nonnatural fluorescent amino acids. (2006)
  • 著者名/発表者名: Nakata, H., Ohtsuki, T., Abe, R., Hohsaka, T., Sisido, M.
  • 雑誌名: Analytical Biochemistry 348 ページ: 321-323
• [雑誌論文] Multiple incorporation of non-natural amino acids into a single protein using tRNAs with non-standards structures. (2005)
  • 著者名/発表者名: Ohtsuki, T., Manabe, T., Sisido, M.
  • 雑誌名: FEBS letters 579 ページ: 6769-6774
• [雑誌論文] Four-base condon/anticondon strategy and non-enzymatic aminoacylation for protein engineering with nonnatural amino acids. (2005)
  • 著者名/発表者名: Sisido, M., Ninomiya, K., Ohtsuki, T., Hohsaka, T.
  • 雑誌名: Methods 36 ページ: 270-278