| 研究課題/領域番号 |
17770124
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
生物物理学
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
権田 幸祐 東北大学, 先進医工学研究機構, 助手 (80375435)
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| 研究期間 (年度) |
2005 – 2006
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| 研究課題ステータス |
完了 (2006年度)
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| 配分額 *注記 |
3,700千円 (直接経費: 3,700千円)
2006年度: 700千円 (直接経費: 700千円)
2005年度: 3,000千円 (直接経費: 3,000千円)
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| キーワード | Centrin / 電位依存性Ca^<2+>チャンネル / Ca^<2+> / EF-hand / 繊毛運動 / 細胞運動 |
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| 研究概要 |
ゾウリムシの繊毛の波打ち運動の方向は、繊毛膜上の電位依存性Ca^<2+>チャンネルの活性化によって制御される。これまで、このチャンネルの必須制御因子としてCa^<2+>結合蛋白質Centrinを同定した。Centrinの機能部位の特定を分子遺伝学的手法で試みた結果、4つのCa^<2+>結合部位(EF-handl〜4)の内EF-hand4とN末の35アミノ酸が重要な役割を果たしていることを明らかにした。
平成18年度は、これらの機能部位がCentrinの立体構造に与える影響を調べるために、野生型Centrinを大腸菌の系を用いて発現・精製した。精製した蛋白質をCentrinの突然変異株cnrCの細胞質内に顕微注入した結果、変異形質が治癒され電位依存性Ca^<2+>チャンネルの活性化が見られた。このことは、リコンビナントCentrinが内在性のCentrinと同等の機能を持つことを示している。次に、リコンビナントCentrinをベースとして、N末の35アミノ酸を欠失させたCentrin(N末欠損型)とEF-hand4を含むC末側の28アミノ酸を欠失させたcnrCタイプのCentrin(cnrC型)を調製した。野生型、N未欠損型、cnrC型Centrinをそれぞれ0.1mM EGTA存在下もしくは0.1mM CaCl_2存在下で保温した後、それぞれのサンプルをSDS-PAGEとNative-PAGEで解析した。その結果、SDS-PAGEのパターンに違いは見られなかったが、野生型とcnrC型CentrinはNative-PAGEにおいて、Ca^<2+>存在下で見かけの分子量が大きくなっていた。一方、N末欠損型は、Native-PAGEにおいて、Ca^<2+>の有無での移動度の変化は他の2者に比べて僅かであった。N末欠損型は全てのEF-handが正常でCa^<2+>+の結合性には問題無いと考えられることからも、CentrinのCa^<2+>依存的な立体構造の変化にはN末部分が重要な役割をしていることが示唆された。また、野生型とcnrC型においてはCa^<2+>の存在下の方が見かけの分子量が大きくなっていることから、CentrinはCa^<2+>の依存的に構造が開いたような状況になることが推測された。
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