| 研究課題/領域番号 |
17790301
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
ウイルス学
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
花木 賢一 東京大学, 大学院医学系研究科, 助手 (40376421)
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| 研究期間 (年度) |
2005 – 2006
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| 研究課題ステータス |
完了 (2006年度)
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| 配分額 *注記 |
3,500千円 (直接経費: 3,500千円)
2006年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
2005年度: 2,400千円 (直接経費: 2,400千円)
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| キーワード | PCR / ELISA / 核酸標識抗体 / B型肝炎ウイルス |
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| 研究概要 |
イムノPCR法を安価、迅速、簡便、超高感度、かつ多検体処理可能な抗原検出法にするために検討を行って、以下のことを確立した。
1.レポーターDNA(rDNA)は76塩基の合成DNAとし、rDNAを抗原認識抗体に直接化学標識した。
2.PCRは最短時間で十分な増幅を実現するために、40分(35サイクル)で完了する条件を決定した。
3.PCR産物の検出は、2通りのPCR-ELISA:ビオチン標識プライマーとジゴキシゲニン(dig)標識プライマーまたはdig標識ヌクレオチドによるPUR法を碓立した。PCR-ELISAはストレプトアビジン固相マイクロプレートを用いて常法により行った結果、dig標識ヌクレオチドを用いたPCR法がdig標識プライマーを用いたPCR法よりも検出限界は100倍優れていた。
イムノPCR法はB型肝炎ウイルスS抗原(HBsAg)を常法によりPCRチューブへ固相化して検討した。そして、既存法であるELISAプレートによるHBsAgの関節抗体法の検出限界が210pg/mLであったのに対し、dig標識プライマーを用いたイムノPCR法のそれは500fg/mLであった。(420倍の検出限界向上)。また、全工程にかかる時間は約3時間であったことから、概ね所期の目標を達成することができた。dig標識ヌクレオチドを用いたイムノPCR法の検出限界は更に向上すると期待される反面、ランニングコストが大きい欠点がある。そのため、コストを考慮した反応組成の最適化を検討している。
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