| 研究概要 |
1.CCNファミリーに属する遺伝子の全長DNAのサブクローニング
CCN1/Cyr61(1140bp),CCN2/CTGF(1047bp),CCN3/Nov(1065bp)の3つのマウス遺伝子配列の全長をPCR法にて増幅,精製した後,以下の2種類のベクターにこれら全長DNA配列を挿入し,プラスミドDNAを獲得した。
(1)RNAプロモーターが付与されているpGEM-Tベクター(3.0kb):このベクターが挿入されたプラスミドDNAの獲得によって,全長DNA配列からのsiRNAライブラリー作製が可能となった。
(2)HAタグおよびGFP配列が付与されたpIRES-hrGFP-2aベクター(5.0kb):このベクターが挿入されたプラスミドDNAの獲得によって,(1)付与されているGFP配列のため,培養細胞にトランスフェクションが行われるとGFPの蛍光発色が得られ,さらに(2)HAタグが付与されているため,細胞中におけるタンパク質レベルでの遺伝子発現強度をウエスタンブロット法によって解析が可能となった。
2.CCNファミリーに属する遺伝子の全長DNAのsiRNAライブラリーの作製
獲得したpGEM-TベクターのプラスミドDNAをテンプレートとし,T7RNAプロモーターを含んだ二本鎖DNAを作製し,in vitro転写反応後に各遺伝子の全長二本鎖RNAを作製した。その後,リコンビナントDicerを用いて,二本鎖RNAに対するプロセッシング反応を行い,21〜23塩基のsiRNAライブラリーを獲得した。
3.CCNファミリーに属する遺伝子の発現パターンの解析
各発生段階の胎生期および生後マウスを用い,歯および歯周組織における遺伝子の発現パターンをin situ hybridization法,タンパク質の発現パターンを免疫組織化学的方法によって検討を行った。
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