蛍光バイオセンサーを用いたミトコンドリア分岐鎖アミノ酸輸送体の同定およびその解析

• 研究課題/領域番号: 17H03654
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 機能生物化学
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 今村 博臣 京都大学, 生命科学研究科, 准教授 (20422545)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2019年度)
• 配分額: 17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円); 2019年度: 5,460千円 (直接経費: 4,200千円、間接経費: 1,260千円); 2018年度: 5,850千円 (直接経費: 4,500千円、間接経費: 1,350千円); 2017年度: 6,110千円 (直接経費: 4,700千円、間接経費: 1,410千円)
• キーワード: 分岐鎖アミノ酸 / トランスポーター / ライブイメージング / FRET / イメージング / バイオセンサー

研究実績の概要

１．ミトコンドリア内バリン輸送へのグルタミン要求性の発見
ミトコンドリア内に分岐鎖アミノ酸蛍光バイオセンサーを発現させた細胞のイメージングをおこないながら、培地を通常のDMEMからロイシン、イソロイシン、あるいはバリンのみを含む培地へ交換した。その結果、ロイシンやイソロイシンを含む培地に変換した場合はバイオセンサーのFRETシグナルに変化はほとんど見られなかった一方、バリンを含む培地に変換した場合は、FRETシグナルの低下が観察された。興味深いことに、バリンのほかにグルタミンが含まれている場合は、FRETシグナルの低下はほぼ抑制された。すなわち、細胞質からミトコンドリア内へのバリンの輸送にはグルタミンが必要であることが示唆された。
２．ミトコンドリア内膜のバリン輸送体のスクリーニング
上記１の実験結果より、バリン輸送体はロイシンやイソロイシンの輸送体とは異なりグルタミンを要求すると考えられたことから、分岐鎖アミノ酸蛍光バイオセンサーを恒常的にミトコンドリアに発現するHeLa細胞をsiRNAで処理し、バリンのみが含まれている培地とバリンとグルタミンが含まれている培地で、FRETシグナルを比較した。その結果、３種類の遺伝子のsiRNAで有意にFRETシグナルの低下が観察された。このことから、この３種類の遺伝子のいずれかあるいは全てがバリンのミトコンドリア内輸送に関与していることが示唆された。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

siRNAライブラリーを用いたスクリーニングにより、当初目標としていた分岐鎖アミノ酸輸送体の候補遺伝子の絞り込みをおこなうことができたため、本研究プロジェクトは概ね順調に進展していると考えられる。

今後の研究の推進方策

１．輸送体の生化学的解析
RNAiスクリーニングによって同定された輸送体をHEK293細胞で大量発現させる。発現した輸送体をアフィニティークロマトグラフィーによって精製した上でリポソームに組み込む。放射性ラベルしたアミノ酸がリポソームの外から内に取り込まれる活性を指標に、RNAiスクリーニングで得られた輸送体が実際に分岐鎖アミノ酸を輸送するかどうかを確認する。また、分岐鎖アミノ酸以外のアミノ酸についての輸送活性を測定することで、輸送体の基質特異性を明らかにする。
２．輸送体の分子細胞生物学的解析
絞り込まれた輸送体に標識タグを付加して発現させ、タグ抗体を用いた免疫染色によって、その輸送体の細胞内局在を確認する。並行して、蛍光タンパク質と輸送体を融合させて細胞に発現させ、その局在を蛍光顕微鏡で解析する。次に、輸送体の細胞レベルでの機能を調べるため、ゲノム編集によって輸送体遺伝子をノックアウトした細胞を作製し、ミトコンドリア内アミノ酸濃度、呼吸活性、ミトコンドリアの数と形態、細胞内ATP濃度等に与える影響を解析する。

研究成果

• [雑誌論文] Spindle pole body movement is affected by glucose and ammonium chloride in fission yeast (2019)
  • 著者名/発表者名: Ito H, Sugawara T, Shinkai S, Mizukawa S, Kondo A, Senda H, Sawai K, Ito K, Suzuki S, Takaine M, Yoshida S, Imamura H, Kitamura K, Namba T, Tate SI, Ueno M
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 巻: 511 ページ: 820-825
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2019.02.128
  • 査読あり
• [雑誌論文] Reliable imaging of ATP in living budding and fission yeast (2019)
  • 著者名/発表者名: Takaine M, Ueno M, Kitamura K, Imamura H, Yoshida S.
  • 雑誌名: Journal of Cell Science 巻: 132 ページ: 1-11
  • DOI: 10.1242/jcs.230649
  • 査読あり
• [雑誌論文] PPARα-Mediated Positive-Feedback Loop Contributes to Cold Exposure Memory (2019)
  • 著者名/発表者名: Alfaqaan Soaad、Yoshida Tomoki、Imamura Hiromi、Tsukano Chihiro、Takemoto Yoshiji、Kakizuka Akira
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 9 ページ: 4538-4538
  • DOI: 10.1038/s41598-019-40633-3
  • NAID: 120006591437
  • 査読あり / オープンアクセスとしている
• [雑誌論文] Automatic Quantitative Segmentation of Myotubes Reveals Single-cell Dynamics of S6 Kinase Activation (2018)
  • 著者名/発表者名: Inoue Haruki、Kunida Katsuyuki、Matsuda Naoki、Hoshino Daisuke、Wada Takumi、Imamura Hiromi、Noji Hiroyuki、Kuroda Shinya
  • 雑誌名: Cell Struct. Funct. 巻: 43 号: 2 ページ: 153-169
  • DOI: 10.1247/csf.18012
  • NAID: 130007420407
  • ISSN: 0386-7196, 1347-3700
  • 査読あり / オープンアクセスとしている
• [雑誌論文] Shear stress augments mitochondrial ATP generation that triggers ATP release and Ca2+ signaling in vascular endothelial cells. (2018)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto Kimiko、Imamura Hiromi、Ando Joji
  • 雑誌名: Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 巻: 315
  • DOI: 10.1152/ajpheart.00204.2018
  • 査読あり / オープンアクセスとしている
• [雑誌論文] A Trace Amount of Galactose, a Major Component of Milk Sugar, Allows Maturation of Glycoproteins during Sugar Starvation (2018)
  • 著者名/発表者名: Sasaoka Norio、Imamura Hiromi、Kakizuka Akira
  • 雑誌名: iScience 巻: 10 ページ: 211-221
  • DOI: 10.1016/j.isci.2018.11.035
  • NAID: 120006715477
  • 査読あり / オープンアクセスとしている
• [雑誌論文] General anesthetics cause mitochondrial dysfunction and reduction of intracellular ATP levels (2018)
  • 著者名/発表者名: Kishikawa JI, Inoue Y, Fujikawa M, Nishimura K, Nakanishi A, Tanabe T, Imamura H, Yokoyama K.
  • 雑誌名: PLOS ONE 巻: 13
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0190213
  • 査読あり / オープンアクセスとしている
• [雑誌論文] Analysis of mitochondrial function in human induced pluripotent stem cells from patients with mitochondrial diabetes due to the A3243G mutation. (2018)
  • 著者名/発表者名: Matsubara M, Kanda H, Imamura H, Inoue M, Noguchi M, Hosoda K, Kakizuka A, Nakao K.
  • 雑誌名: Sci Rep. 巻: 8 ページ: 949-949
  • DOI: 10.1038/s41598-018-19264-7
  • NAID: 120006502575
  • 査読あり / オープンアクセスとしている
• [雑誌論文] Human AK2 links intracellular bioenergetics redistribution to the fate of hematopoietic progenitors. (2018)
  • 著者名/発表者名: Oshima Koichi、Watanabe Akira、Nakahata Tatsutoshi、Saito Megumu K. et al.
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun. 巻: 497 ページ: 719-719
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2018.02.139
  • NAID: 120006466601
  • 査読あり / オープンアクセスとしている / 国際共著/国際学会である
• [雑誌論文] A Transient Rise in Free Mg2+ Ions Released from ATP-Mg Hydrolysis Contributes to Mitotic Chromosome Condensation (2018)
  • 著者名/発表者名: Maeshima Kazuhiro、Matsuda Tomoki、Shindo Yutaka、Imamura Hiromi、Tamura Sachiko、Imai Ryosuke、Kawakami Syoji、Nagashima Ryosuke、Soga Tomoyoshi、Noji Hiroyuki、Oka Kotaro、Nagai Takeharu
  • 雑誌名: Current Biology 巻: 28 ページ: 444-451
  • DOI: 10.1016/j.cub.2017.12.035
  • NAID: 120006380520
  • 査読あり / オープンアクセスとしている
• [雑誌論文] Visualization of long-term Mg2+ dynamics in apoptotic cells using a novel targetable fluorescent probe. (2017)
  • 著者名/発表者名: Matsui Y, Funato Y, Imamura H, Miki H, Mizukami S, Kikuchi K
  • 雑誌名: Chemical Science 巻: 8 ページ: 8255-8264
  • DOI: 10.1039/c7sc03954a
  • 査読あり / オープンアクセスとしている
• [雑誌論文] Monitoring ATP dynamics in electrically active white matter tracts (2017)
  • 著者名/発表者名: Trevisiol A, Saab AS, Winkler U, Marx G, Imamura H, Moebius W, Kusch K, Nave KA, Hirrlinger J.
  • 雑誌名: eLife 巻: 6
  • DOI: 10.7554/elife.24241
  • NAID: 120006318886
  • 査読あり / オープンアクセスとしている / 国際共著/国際学会である
• [雑誌論文] Distinct intracellular Ca2+dynamics regulate apical constriction and differentially contribute to neural tube closure (2017)
  • 著者名/発表者名: Suzuki, M., Sato, M., Koyama, H., Hara, Y., Hayashi, K., Yasue, N., Imamura, H., Fujimori, T., Nagai, T., Campbell, RE., Ueno, N.
  • 雑誌名: Development 巻: 144 ページ: 1307-1316
  • DOI: 10.1242/dev.141952
  • 査読あり / オープンアクセスとしている / 国際共著/国際学会である / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Cell competition with normal epithelial cells promotes apical extrusion of transformed cells through metabolic?changes. (2017)
  • 著者名/発表者名: Shunsuke Kon, et al.
  • 雑誌名: Nat Cell Biol 巻: 印刷中 ページ: 530-41
  • DOI: 10.1038/ncb3509
  • 査読あり / オープンアクセスとしている / 国際共著/国際学会である / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] RLR-mediated antiviral innate immunity requires oxidative phosphorylation activity. (2017)
  • 著者名/発表者名: Yoshizumi T, Imamura H, Taku T, Kuroki T, Kawaguchi A, Ishikawa K, Nakada K, Koshiba T
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 7 ページ: 5379-5379
  • DOI: 10.1038/s41598-017-05808-w
  • NAID: 120006364105
  • 査読あり / オープンアクセスとしている
• [雑誌論文] ATP Maintenance via Two Types of ATP Regulators Mitigates Pathological Phenotypes in Mouse Models of Parkinson's Disease. (2017)
  • 著者名/発表者名: Nakano Masaki、Imamura Hiromi、Sasaoka Norio、Yamamoto Masamichi、Uemura Norihito、Shudo Toshiyuki、Fuchigami Tomohiro、Takahashi Ryosuke、Kakizuka Akira
  • 雑誌名: EBioMedicine. 巻: 22 ページ: 225-241
  • DOI: 10.1016/j.ebiom.2017.07.024
  • NAID: 120006338063
  • 査読あり / オープンアクセスとしている
• [雑誌論文] Fusion protein analysis reveals the precise regulation between Hsp70 and Hsp100 during protein disaggregation (2017)
  • 著者名/発表者名: Hayashi S, Nakazaki Y, Kagii K, Imamura H, Watanabe YH.
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 7 ページ: 8648-8648
  • DOI: 10.1038/s41598-017-08917-8
  • NAID: 120006364083
  • 査読あり / オープンアクセスとしている
• [学会発表] 新規発光型ATPバイオセンサーを用いた細胞内および細胞外ATPダイナミクスの定量的観測系の構築 (2018)
  • 著者名/発表者名: 松岡篤志、吉田有希、垣塚彰、今村博臣
  • 学会等名: 日本生体エネルギー研究会 第４４回討論会
• [学会発表] Single-cell imaging of intracellular ATP dynamics during apoptosis using a caspase-resistant FRET-based biosensor (2018)
  • 著者名/発表者名: Imamura H, Sakamoto S, Yoshida T, Kakizuka A
  • 学会等名: International Meeting on Optical Biosensors
  • 国際共著/国際学会である
• [学会発表] Imaging of intracellular ATP level revealed pannexin1-mediated programmed ATP decrease in apoptosis (2017)
  • 著者名/発表者名: Imamura Hiromi, Sakamoto Shuichiro, Yoshida Tomoki, Kakizuka Akira
  • 学会等名: 19th International Union for Pure and Applied Biophysics Congress / 11th European Biophysics Congress
  • 国際共著/国際学会である
• [学会発表] FRET型ATPセンサーを用いたショウジョウバエ神経細胞におけるATPの濃度と消費速度の可視化 (2017)
  • 著者名/発表者名: 津山泰一、坪内朝子、碓井理夫、今村博臣、上村匡
  • 学会等名: 日本生体エネルギー研究会 第４３回討論会
• [学会発表] ルシフェラーゼ断片の相補的再構成を用いた新規発光ATPバイオセンサーの開発 (2017)
  • 著者名/発表者名: 松岡篤志、垣塚彰、今村博臣
  • 学会等名: 日本生体エネルギー研究会 第４３回討論会
• [学会発表] ツメガエル卵細胞におけるATPの役割の検証 (2017)
  • 著者名/発表者名: 井尻貴之、岸川淳一、今村博臣、上野秀一、岩尾康宏、横山謙、佐藤賢一
  • 学会等名: 日本生体エネルギー研究会 第４３回討論会
• [学会発表] FRET型蛍光バイオセンサーを用いたミトコンドリア分岐鎖アミノ酸輸送体の探索 (2017)
  • 著者名/発表者名: 中嶋瞳、吉田有希、垣塚彰、今村博臣
  • 学会等名: 日本生体エネルギー研究会 第４３回討論会
• [学会発表] MPTPパーキンソン病モデルにおけるATP制御薬の発症緩和効果 (2017)
  • 著者名/発表者名: 中野将希、今村博臣、笹岡紀男、山本正道、上村紀仁、首藤敏之、渕上智弘、高橋良輔、垣塚彰
  • 学会等名: 日本生体エネルギー研究会 第４３回討論会
• [学会発表] 出芽酵母の細胞内ATP変動を制御する仕組み (2017)
  • 著者名/発表者名: 高稲正勝、今村博臣、吉田知史
  • 学会等名: 日本生体エネルギー研究会 第４３回討論会