蛍光非天然蛍光アミノ酸導入による、イオンチャネルの機能する姿と作動機構の解析

• 研究課題/領域番号: 17H04021
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 生理学一般
• 研究機関: 生理学研究所
• 研究代表者: 久保 義弘 生理学研究所, 分子細胞生理研究領域, 教授 (80211887)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2019年度)
• 配分額: 17,940千円 (直接経費: 13,800千円、間接経費: 4,140千円); 2019年度: 5,330千円 (直接経費: 4,100千円、間接経費: 1,230千円); 2018年度: 5,460千円 (直接経費: 4,200千円、間接経費: 1,260千円); 2017年度: 7,150千円 (直接経費: 5,500千円、間接経費: 1,650千円)
• キーワード: ATP受容体チャネル / 蛍光非天然アミノ酸 / 動的構造変化 / 生体分子 / イオンチャネル

研究成果の概要

典型的膜電位センサーを有しないATP受容体チャネルP2X2の膜電位依存的ゲーティングの分子基盤の解明を目的として、蛍光非天然アミノ酸 (fUAA)の分子内導入を用いた光学的解析を行った。第2膜貫通部位のAla337の位置にfUAAを導入した際、膜電位依存的蛍光強度変化が観察された。その変化は、膜電位全域でリニアであったため、fUAAのelectrochromicな性質によること、337が強い電場内に位置することが示された。ATP存在下で、第1膜貫通部位の Phe44がAla337の近傍に位置するため、強い電場内における両者の相互作用が、膜電位依存性の基盤であることが示唆された。

研究成果の学術的意義や社会的意義

ATP受容体チャネルP2X2は、典型的な膜電位センサーが無いにも関わらず、未知のメカニズムにより膜電位依存的ゲーティングを示す。本研究では、この根源的な謎にアプローチした。本研究の特徴として、非天然蛍光アミノ酸を分子内に導入し、膜電位固定下で蛍光測光を行い、膜電位依存的構造変化等を捉える革新的な方法論を用いた点があげられる。本研究で得られた知見、および確立した方法論は、今後、膜タンパク質研究に広く敷衍しうる可能性を有する。

研究成果

• [国際共同研究] Weizmann Institute of Science(イスラエル)
• [国際共同研究] Sussex University(英国)
• [国際共同研究] University of California Berkeley(米国)
• [国際共同研究] McGill University(カナダ)
• [雑誌論文] Non-sedating antihistamines block G-protein-gated inwardly rectifying K+ channels. (2019)
  • 著者名/発表者名: Chen IS, Liu C, Tateyama M, Karbat I, Uesugi M, Reuveny E, Kubo Y
  • 雑誌名: Br J Pharmacol 巻: 176 号: 17 ページ: 3161-3179
  • DOI: 10.1111/bph.14717
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Phosphoinositides modulate the voltage dependence of two-pore channel 3 (2019)
  • 著者名/発表者名: Shimomura T, Kubo Y
  • 雑誌名: J Gen Physiol 巻: 151 号: 8 ページ: 986-1006
  • DOI: 10.1085/jgp.201812285
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Congenital goitrous hypothyroidism is caused by dysfunction of the iodide transporter SLC26A7 (2019)
  • 著者名/発表者名: Ishii Jun、Suzuki Atsushi、Kimura Toru、Tateyama Michihiro、Tanaka Tatsushi、Yazawa Takuya、Arimasu Yu、Chen I-Shan、Aoyama Kohei、Kubo Yoshihiro、Saitoh Shinji、Mizuno Haruo、Kamma Hiroshi
  • 雑誌名: Communications Biology 巻: 2 号: 1 ページ: 1-11
  • DOI: 10.1038/s42003-019-0503-6
  • 査読あり
• [雑誌論文] Functional properties of axolotl transient receptor potential ankyrin 1 revealed by the heterologous expression system (2019)
  • 著者名/発表者名: Oda M, Ogino H, Kubo Y, Saitoh O
  • 雑誌名: Neuroreport 巻: 30 号: 5 ページ: 323-330
  • DOI: 10.1097/wnr.0000000000001197
  • 査読あり
• [雑誌論文] SLO potassium channels antagonize premature decision making in C. elegans (2018)
  • 著者名/発表者名: Aoki I, Tateyama M, Shimomura T, Ihara K, Kubo Y, Nakano S, Mori I.
  • 雑誌名: Commun Biol. 巻: 1 号: 1 ページ: 123-123
  • DOI: 10.1038/s42003-018-0124-5
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Gi/o-coupled muscarinic receptors co-localize with GIRK channel for efficient channel activation. (2018)
  • 著者名/発表者名: Tateyama M, Kubo Y
  • 雑誌名: PLOS ONE 巻: 13 号: 9 ページ: e0204447-e0204447
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0204447
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Two mutations at different positions in the CNBH domain of the hERG channel accelerate deactivation and impair the interaction with the EAG domain. (2018)
  • 著者名/発表者名: Kume S, Shimomura T, Tateyama M, Kubo Y
  • 雑誌名: Journal of Physioloby 巻: 596 号: 19 ページ: 4629-4650
  • DOI: 10.1113/jp276208
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structural properties determining low K+affinity of the selectivity filter in the TWIK1 K+channel (2018)
  • 著者名/発表者名: Tsukamoto Hisao、Higashi Masahiro、Motoki Hideyoshi、Watanabe Hiroki、Ganser Christian、Nakajo Koichi、Kubo Yoshihiro、Uchihashi Takayuki、Furutani Yuji
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 巻: 293 号: 18 ページ: 6969-6984
  • DOI: 10.1074/jbc.ra118.001817
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Ivermectin and its target molecules: shared and unique modulation mechanisms of ion channels and receptors by ivermectin. (2018)
  • 著者名/発表者名: Chen IS, Kubo Y.
  • 雑誌名: J Physiol 巻: 印刷中 号: 10 ページ: 1833-1845
  • DOI: 10.1113/jp275236
  • 査読あり
• [雑誌論文] Ivermectin activates GIRK channels in a PIP2 -dependent, Gβγ-independent manner and an amino acid residue at the slide helix governs the activation. (2017)
  • 著者名/発表者名: Chen, I.S., Tateyama, M., Fukata, Y., Uesugi, M., & Kubo, Y.
  • 雑誌名: Journal of Physiology 巻: 595 号: 17 ページ: 5895-5912
  • DOI: 10.1113/jp274871
  • 査読あり
• [学会発表] Inhibitory mechanisms of G-protein-gated inwardly rectifying K+ channel by antihistamines (2020)
  • 著者名/発表者名: Chen IS, Liu C, Tateyama M, Karbat I, Uesugi M, Reuveny E, Kubo Y
  • 学会等名: Biophysical Society 64th Annual Meeting
  • 国際学会
• [学会発表] PI(3,4)P2-dependent modulation of voltage dependence in Two-Pore Chanel 3 (2020)
  • 著者名/発表者名: Shimomura T, Kubo Y
  • 学会等名: Biophysical Society 64th Annual Meeting
  • 国際学会
• [学会発表] Relative voltage sensor activation kinetics determines the effects of sensor neutralization in voltage-gated sodium channels (2020)
  • 著者名/発表者名: Brake, N, Manchino A, Yan Y, Shimomura T, Kubo Y, Bowie D, Khadra A
  • 学会等名: Biophysical Society 64th Annual Meeting
• [学会発表] PI(3,4)P2- and voltage-dependent gating of two-pore Na+ channel 3 (2020)
  • 著者名/発表者名: Shimomura T, Hirazawa K, Kubo Y
  • 学会等名: The 97th Annual Meeting of the Physiological Society of Japan
• [学会発表] Chen IS, Kubo Y (2020)
  • 著者名/発表者名: Roles of the pore helix in the regulation mechanisms of gating of GIRK channels
  • 学会等名: The 97th Annual Meeting of the Physiological Society of Japan
• [学会発表] Analysis of the structural dynamics of Two-pore Na+ channel 3 (2020)
  • 著者名/発表者名: Hirazawa K, Shimomura T, Kubo Y
  • 学会等名: The 97th Annual Meeting of the Physiological Society of Japan
• [学会発表] Activation of the THIK-2 channels by Gi/o and Gq coupled receptors (2020)
  • 著者名/発表者名: Tateyama M, Kubo Y
  • 学会等名: The 97th Annual Meeting of the Physiological Society of Japan
• [学会発表] Physiological roles of Prrt3, an orphan metabotropic receptor: Comprehensive behavioral test battery analysis using homozgous full gene knock-out mice derived from flox mice (2020)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto T, Hattori S, Zhou L, Natsume R, Konno K, Chen IS, Watanabe M, Sakimura K, Miyakawa T, Kubo Y
  • 学会等名: The 97th Annual Meeting of the Physiological Society of Japan
• [学会発表] ATP- and voltage-dependent gating of P2X2 receptor analyzed by voltage-clamp fluorometry (2020)
  • 著者名/発表者名: Andriani RT, Kubo Y
  • 学会等名: The 97th Annual Meeting of the Physiological Society of Japan
• [学会発表] Modulation of ion channel function by Sigma-1 receptor, a multimodal membrane protein (2020)
  • 著者名/発表者名: Liu C, Chen IS, Murrell-Lagnado R, Kubo Y
  • 学会等名: The 97th Annual Meeting of the Physiological Society of Japan
• [学会発表] ATP-and voltage-dependent gating of P2X2 receptor analyzed by voltage-clamp fluorometry (2019)
  • 著者名/発表者名: Andriani RT, Kubo Y
  • 学会等名: The 7th International Ion Channel Conference
  • 国際学会
• [学会発表] Phosphoinositides modulate the voltage dependence of Two-Pore Channel 3 (2019)
  • 著者名/発表者名: Kubo Y
  • 学会等名: The 7th International Ion Channel Conference
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Phosphoinositides modulate the voltage dependence in Two-Pore Na+ Channel 3 (2019)
  • 著者名/発表者名: Kubo Y
  • 学会等名: The Ion Channel Modulation Symposium
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] A key interaction for modulation of voltage dependence by phosphoinositides in two-pore channel 3 (2019)
  • 著者名/発表者名: Shimomura T, Kubo Y
  • 学会等名: 9th FAOPS congress
  • 国際学会
• [学会発表] Analysis of dynamic structural rearrangements of Two-Pore Na+ Channel 3 by voltage clamp fluorometry (2019)
  • 著者名/発表者名: Hirazawa K, Shimomura T, Kubo Y
  • 学会等名: 9th FAOPS congress
  • 国際学会
• [学会発表] Voltage-clamp fluorometry analyses of voltage-dependent gating of ATP receptor channel P2X2 (2019)
  • 著者名/発表者名: Rizki AT, Kubo Y
  • 学会等名: 9th FAOPS congress
  • 国際学会
• [学会発表] Effects of antihistamine drugs on G-protein-gated inwardly rectifying K+ channels (2019)
  • 著者名/発表者名: Chang L, Chen IS, Kubo Y
  • 学会等名: 9th FAOPS congress
  • 国際学会
• [学会発表] Metabotropic glutamate receptor mGlu2 regulates signaling via Gq-coupled serotonergic receptor (2019)
  • 著者名/発表者名: Tateyama M, Kubo Y
  • 学会等名: 9th FAOPS congress
  • 国際学会
• [学会発表] Regulation mechanisms of G-protein-gated inwardly rectifying K+channel by small molecules (2019)
  • 著者名/発表者名: Chen IS, Liu C, Kubo Y
  • 学会等名: 9th FAOPS congress
  • 国際学会
• [学会発表] Analyses of the structural rearrangements of P2X2 receptor by voltage-clamp fluorometry using fUAA fluorophore - quencher pairing (2018)
  • 著者名/発表者名: Andriani RT, Kubo Y
  • 学会等名: 第95回日本生理学会大会
• [学会発表] Modulation of the voltage dependence by phosphoinositides in Two-Pore Na+ Channel 3 (2018)
  • 著者名/発表者名: Shimomura T, Kubo Y
  • 学会等名: 第95回日本生理学会大会
• [学会発表] Novel regulation mechanisms of the GIRK channel activity by small molecules (2018)
  • 著者名/発表者名: Chen IS, Kubo Y
  • 学会等名: 第95回日本生理学会大会
• [学会発表] FRET analyses of the effect of Phe860Glu mutation on the interaction between the N- and C- terminal cytoplasmic domains in hERG channel (2018)
  • 著者名/発表者名: Kume S, Tateyama M, Kubo Y
  • 学会等名: 第95回日本生理学会大会
• [学会発表] Effects and activation mechanisms of ivermectin on G-protein-gated inwardly rectifying potassium channels. (2018)
  • 著者名/発表者名: Chen IS, Tateyama M, Fukata Y, Uesugi M, Kubo Y
  • 学会等名: 62nd Annual Meeting of Biophysical Society
  • 国際学会
• [学会発表] Activation mechanisms and binding sites of ivermectin in G-protein-gated inwardly rectifying potassium channels (2017)
  • 著者名/発表者名: Kubo Y
  • 学会等名: IUPS 38th World Congress
  • 国際学会 / 招待講演