| 研究実績の概要 |
本研究では細胞内シグナル伝達分子のERKおよびAktの活性の動的変化が細胞周期の進行に及ぼす寄与を明らかにすることを目的とした。
1. 細胞周期を通じたERKとAktのシグナル活性の動的変化の観察と定量
MCF10A細胞を用いて細胞周期の進行過程のERK活性、Akt活性の変化を観察するとともに、細胞周期マーカーを用いた各細胞周期段階の定量を行った。細胞周期の状態の可視化には昨年度用いていたSLBPに変えてPIP-tagと呼ばれるマーカーを使用した (Grant et al., Cell Cycle,2018)。通常の細胞培養条件でのイメージングとともに、血清や細胞増殖因子を取り除いた培地を用いて細胞周期をG1期で停止させ、EGF濃度の違いがもたらす細胞周期の進行への影響を定量化した。また、細胞周期が進行している過程で、MEK, PI3K, Aktなどの阻害剤を加え、細胞周期進行の遅れや特定の段階での停止などを定量した。
2. 細胞周期操作のための光遺伝学の導入
光遺伝学的手法を用いた人為的な細胞周期進行の操作を試みた。光刺激を行うにあたり、先行研究で用いられていた機械の作製に取り組んだ (Bugaj et al., Science, 2018)。血清と細胞増殖因子を含まない細胞培養用の培地でMCF10A細胞をG1期にとどめ、ERK活性のみ、Akt活性のみ、ERK, Aktの双方を活性化させる条件で細胞がS期に入る割合を定量した。シグナルの活性化には青色光に応答するCRY2-CIBNの系を利用した。その結果、ERK, Aktの双方のシグナル活性を光刺激によって活性化させた条件では、片方のシグナル活性を上げた場合より高い割合で細胞がG1/S期のチェックポイントを通過することが可能になった。
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