研究課題
特別研究員奨励費
エゾムラサキツツジが生産するメロテルペノイドの一種ダウリクロメン酸（daurichromenic acid、DCA）は極めて強力な抗HIV活性を示す。本研究では、植物メロテルペノイド酸化閉環酵素であるDCA synthase及びカンナビノイド合成酵素（THCA synthase）の結晶構造解析による構造機能の解明を目的として、その基盤となる組換え酵素の発現システムについて各種宿主を用いて検討を行った。本年度はBY-2に比べ遺伝子組換えが容易で、また組換え酵素の酵素的な糖鎖除去が可能である酵母Pichia pastorisを宿主とし、DCA synthase及びTHCA synthaseの高発現株の作製を試みた。まずTHCA synthase及びDCA synthaseのcDNAをpPICZAベクターに挿入し、発現カセットを作製した。次いで各発現カセットを切り出し、複数遺伝子の挿入が可能なpAO815及びpPIC3.5Kに順次組み込むことで、各遺伝子の発現カセットを3コピー含むベクターを構築した。次いでエレクトロポレーション法を用いた相同組換えにより P. pastoris に形質転換し、DCA synthaseあるいはTHCA synthaseの発現カセットを1, 4及び7コピー導入した組換え体をそれぞれ調製した。メタノールで発現誘導し、細胞外に分泌した各酵素の活性を測定した結果、THCA synthase及びDCA synthase発現株いずれも、単一コピー組換え体に比べ、4コピー及び7コピー組み換え体ではコピー数の増加に依存して比活性の上昇が確認された。組換え酵素を精製した結果、THCA synthase及びDCA synthaseはいずれも糖鎖付加を受けていることが示唆されたため、7コピー発現株にendoglycosidase Hを導入して共発現株を作製した。
平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
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