ＲＮＡ結合ドメインを用いたｉｎ ｖｉｖｏＲＮＡ解析手法の創製と応用

• 研究課題/領域番号: 17J11266
• 研究種目: 特別研究員奨励費
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 国内
• 研究分野: 生物系薬学
• 研究機関: 明治薬科大学
• 研究代表者: 山田 俊理 明治薬科大学, 薬学部, 特別研究員(PD) (50809811)
• 研究期間 (年度): 2017-04-26 – 2020-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2019年度)
• 配分額: 4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円); 2019年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2018年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2017年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
• キーワード: RNA結合タンパク質 / RNA分解 / NGS解析 / RNA-seq

研究実績の概要

本研究課題では、RNAの生理機能を解明するための手法開発を目指す。開発する手法は、標的RNAを認識するためにRNA結合タンパク質PUMを用いることとしたが、その前提として、内在性PUM自体の機能を解析することを第一の目的とした。
PUMが結合するRNAをゲノムワイドに決定するために、RIP-seqを行いPUMに結合している3097種のRNAを同定した。 次に、PUMによるRNA分解を解析するためにゲノムワイドにRNAの半減期を測定できるBRIC-seqを行った。PUMを欠損させた細胞では、101種のRNAにおいて半減期が有意に上昇した。両者の結果を重ね合わせた結果、48種が同定された。この48種がPUMにより 分解されるRNAである。
PUMによるmRNA分解を抑制するような摂動・生理的条件を探索した。その結果、シスプラチン（CDDP）やカンプトテシン（CPT）などDNA障害を誘導する抗がん剤がPUMのmRNA分解を阻害することを発見した(CDDP・CPTを細胞に添加すると、PUMが減少し分解標的mRNAが上昇する)。特に標的mRNAの中でもPCNAやUBE2Aなどは、損傷乗り換えDNA合成（TLS）に関与することが知られている。実際に申請者はPUMのmRNA分解が抑制されることが、TLS経路の活性化に必須であることを下記の三点により確認した。①PCNAがユビキチン化される、②TLSポリメラーゼが損傷されたDNA上に局在する、③DNA合成が促進する。
以上の結果、細胞はDNA損傷時にPUMを消失させることでmRNAを安定化・増加させ、組み換え損傷DNA修復を活性化することを解明した。
本研究成果をCell Reports誌へと投稿し、リバイス実験を経て採択が決まった。

現在までの達成度 (段落)

令和元年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

令和元年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] Systematic Analysis of Targets of Pumilio-mediated mRNA Decay Reveals that PUM1 Repression by DNA Damage Activates Translesion Synthesis (2020)
  • 著者名/発表者名: Toshimichi Yamada, Naoto Imamachi, Katsutoshi Imamura, Kenzui Taniue, Takeshi Kawamura, Yutaka Suzuki, Masami Nagahama, Nobuyoshi Akimitsu
  • 雑誌名: Cell Reports 巻: －
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Contributions of regulated transcription and mRNA decay to the dynamics of gene expression (2019)
  • 著者名/発表者名: Yamada T., Akimitsu N.
  • 雑誌名: WIREs RNA 巻: 10 号: 1
  • DOI: 10.1002/wrna.1508
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Diminished nuclear RNA decay upon Salmonella infection upregulates antibacterial noncoding RNAs (2018)
  • 著者名/発表者名: Imamura Katsutoshi、Takaya Akiko、Ishida Yo‐ichi、Fukuoka Yayoi、Taya Toshiki、Nakaki Ryo、Kakeda Miho、Imamachi Naoto、Sato Aiko、Yamada Toshimichi、Onoguchi‐Mizutani Rena、Akizuki Gen、Tanu Tanzina、Tao Kazuyuki、Miyao Sotaro、Suzuki Yutaka、Nagahama Masami、Yamamoto Tomoko、Jensen Torben Heick、Akimitsu Nobuyoshi
  • 雑誌名: The EMBO Journal 巻: 37 号: 13
  • DOI: 10.15252/embj.201797723
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Interplay between Transcription and RNA Degradation (2018)
  • 著者名/発表者名: Yamada T, Nagahama M, Akimitsu N
  • 雑誌名: InTech 巻: 1 ページ: 97-114
  • DOI: 10.5772/intechopen.71862
  • ISBN: 9789535138556, 9789535138563
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] 5'-Bromouridine IP Chase (BRIC)-Seq to Determine RNA Half-Lives. (2018)
  • 著者名/発表者名: Yamada T, Imamachi N, Onoguchi-Mizutani R, Imamura K, Suzuki Y, Akimitsu N.
  • 雑誌名: Methods Mol Biol. 巻: 1720 ページ: 1-13
  • DOI: 10.1007/978-1-4939-7540-2_1
  • ISBN: 9781493975396, 9781493975402
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Systematic Analysis of Targets of PUM1-Mediated mRNA Decay Identifies a Role of PUM1 in Regulating DNA Damage Response Pathway (2019)
  • 著者名/発表者名: Yamada T., Nagahama M., Akimitsu N.
  • 学会等名: 第２１回日本RNA学会年会
• [学会発表] Identification of functional targets reveals that supression of Pumilio-mediated mRNA decay increases cell resistance to DNA damage (2019)
  • 著者名/発表者名: Yamada T., Nagahama M., Akimitsu N.
  • 学会等名: 第20回武田科学振興財団生命科学シンポジウム RNAネオバイオロジー
  • 国際学会
• [学会発表] Identification of functional targets reveals that inhibition of Pumilio-mediated mRNA decay increases cell resistance to DNA damage (2018)
  • 著者名/発表者名: Yamada T., Nagahama M., Akimitsu N.
  • 学会等名: 2018 ASCB | EMBO meeting
  • 国際学会
• [学会発表] RNA結合タンパク質研究のためのNGS活用法 (2017)
  • 著者名/発表者名: 山田俊理
  • 学会等名: NGS現場の会
• [学会発表] Combinatorial analysis to study a functional role of an RNA-binding protein in RNA decay (2017)
  • 著者名/発表者名: 山田俊理
  • 学会等名: ConBio2017
• [学会発表] Combinatorial Analysis to Study Functional Role of an RNA-Binding Protein in RNA Decay (2017)
  • 著者名/発表者名: 山田俊理
  • 学会等名: EMBO, Eukaryotic RNA turnover
  • 国際学会