CRISPR-Cas9 nickaseによるDNA二重鎖切断を伴わないゲノム編集

• 研究課題/領域番号: 17K07263
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: システムゲノム科学
• 研究機関: 愛知医科大学
• 研究代表者: 小西 裕之 愛知医科大学, 医学部, 教授 (20344335)
• 研究分担者: 兵頭 寿典 愛知医科大学, 医学部, 講師 (40710645) ; シバスンダラン カルナン 愛知医科大学, 医学部, 講師 (30557096)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2021-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2020年度)
• 配分額: 5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円); 2019年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円); 2018年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円); 2017年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
• キーワード: CRISPR / Cas9 / nickase / ゲノム編集 / ノックイン / tandem paired nicking / ニック / CRISPR/Cas9 / CRISPR-Cas9 / ゲノム生物工学

研究成果の概要

ゲノム編集によるノックインは広汎な生命科学分野への応用が見込まれる有望な遺伝子工学技術であるが、正確性、特異性、安全性などに課題が残されている。本研究では、Cas9 nickaseを通常と違う使い方で用いるtandem paired nicking法（TPN法）によるノックインの研究を行った。さまざまな検討の結果、TPN法は従来法に匹敵するノックイン効率を維持しつつ編集局所のランダムな望まぬ挿入・欠失を飛躍的に減少させうることがわかった。また、同法によるノックインが「ゲノムの守護神」たるp53シグナル経路を攪乱せず、p53活性によるノックイン効率への干渉も受けないことが明らかになった。

研究成果の学術的意義や社会的意義

本研究の結果、TPN法の利用によってノックインに伴う標的ゲノム部位の予期せぬランダム変異を抑えうることがわかった。また、TPN法では標的外部位（オフターゲット部位）のランダム変異が少ないことも示唆されており、ゲノム編集細胞のがん化などの危険性を抑制しうるものと期待される。さらに、DNA損傷反応を制御するp53シグナル経路がTPN法によって攪乱されないことは、同法の安全性を裏付けるものと考えられる。従来法に比肩するノックイン効率が保持されていることも鑑み、TPN法は今後の技術的な洗練を経たのち、将来的には臨床医学、畜産学、植物科学などに応用可能な有用なノックイン法になりうるものと期待される。

研究成果

• [雑誌論文] CD52 is a novel target for the treatment of FLT3-ITD-mutated myeloid leukemia (2021)
  • 著者名/発表者名: 1.Karnan S, Hanamura I, Ota A, Takasugi S, Nakamura A, Takahashi M, Uchino K, Murakami S, Wahiduzzaman M, Vu LQ, Rahman ML, Hasan MN, Hyodo T, Konishi H, Tsuzuki S, Yoshikawa K, Suzuki S, Ueda R, Ejiri M, Hosokawa Y, and Takami A
  • 雑誌名: Cell Death Discovery 巻: -
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Identification of CD24 as a potential diagnostic and therapeutic target for malignant pleural mesothelioma (2020)
  • 著者名/発表者名: KarnanS, Ota A, Murakami H, Rahman ML, Hasan MN, Wahiduzzaman MD, Hanamura I, Vu LQ, Inoko A, Hyodo T, Konishi H, Tsuzuki S, Hosokawa Y.
  • 雑誌名: Cell Death Discovery 巻: 18 号: 1 ページ: 127-139
  • DOI: 10.1038/s41420-020-00364-1
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Novel Interleukin-6 Inducible Gene PDZ-Binding Kinase Promotes Tumor Growth of Multiple Myeloma Cells (2020)
  • 著者名/発表者名: Ota Akinobu、Hanamura Ichiro、Karnan Sivasundaram、Inaguma Shingo、Takei Norio、Lam Vu Quang、Mizuno Shohei、Kanasugi Jo、Wahiduzzaman Md、Rahman Md Lutfur、Hyodo Toshinori、Konishi Hiroyuki、Tsuzuki Shinobu、Ikeda Hiroshi、Takami Akiyoshi、Hosokawa Yoshitaka
  • 雑誌名: Journal of Interferon & Cytokine Research 巻: 40 号: 8 ページ: 389-405
  • DOI: 10.1089/jir.2020.0111
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Targeting MEF2D-fusion Oncogenic Transcriptional Circuitries in B-cell Precursor Acute Lymphoblastic Leukemia (2020)
  • 著者名/発表者名: Shinobu Tsuzuki, Takahiko Yasuda, Shinya Kojima, Masahito Kawazu, Koshi Akahane, Takeshi Inukai, Masue Imaizumi, Takanobu Morishita, Masashi Sanada, Hideki Muramatsu, Yoshiyuki Takahashi, Yasushi Miyazaki, Itaru Matsumura, Hitoshi Kiyoi, Yoshitaka Hosokawa, Hiroyuki Mano, Fumihiko Hayakawa
  • 雑誌名: Blood Cancer Discovery 巻: 1 号: 1 ページ: 82-95
  • DOI: 10.1158/2643-3230.bcd-19-0080
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Discovery of novel molecular characteristics and cellular biological properties in ameloblastoma (2020)
  • 著者名/発表者名: Kondo Sayuri、Ota Akinobu、Ono Takayuki、Karnan Sivasundaram、Wahiduzzaman Md、Hyodo Toshinori、Lutfur Rahman Md、Ito Kunihiro、Furuhashi Akifumi、Hayashi Tomio、Konishi Hiroyuki、Tsuzuki Shinobu、Hosokawa Yoshitaka、Kazaoka Yoshiaki
  • 雑誌名: Cancer Medicine 巻: 9 号: 8 ページ: 2904-2917
  • DOI: 10.1002/cam4.2931
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Bi-allelic loss of FAM46C triggers tumor growth with concomitant activation of Akt signaling in multiple myeloma cells (2020)
  • 著者名/発表者名: Kanasugi J, Hanamura I, Ota A, Karnan S, Vu LQ, Mizuno S, Wahiduzzaman M, Rahman ML, Hyodo T, Konishi H, Tsuzuki S, Hosokawa Y, Takami A
  • 雑誌名: Cancer Science 巻: - 号: 5 ページ: 999-999
  • DOI: 10.1111/cas.14386
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Tandem paired nicking promotes precise genome editing with scarce interference by p53 (2019)
  • 著者名/発表者名: Hyodo T, Rahman ML, Karnan S, Ito T, Toyoda A, Ota A, Wahiduzzaman M, Tsuzuki S, Okada Y, Hosokawa Y, Konishi H.
  • 雑誌名: Cell Rep. 巻: 30 号: 4 ページ: 1195-1207
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2019.12.064
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Establishment and characterization of CRISPR/Cas9-mediated NF2(-/-) human mesothelial cell line: Molecular insight into fibroblast growth factor receptor 2 in malignant pleural mesothelioma (2019)
  • 著者名/発表者名: Wahiduzzaman Md、Karnan Sivasundaram、Ota Akinobu、Hanamura Ichiro、Murakami Hideki、Inoko Akihito、Rahman Md Lutfur、Hyodo Toshinori、Konishi Hiroyuki、Tsuzuki Shinobu、Hosokawa Yoshitaka
  • 雑誌名: Cancer Science 巻: 110 号: 1 ページ: 180-193
  • DOI: 10.1111/cas.13871
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Novel combined Ato-C treatment synergistically suppresses proliferation of Bcr-Abl-positive leukemic cells in vitro and in vivo (2018)
  • 著者名/発表者名: Wahiduzzaman Md、Ota Akinobu、Karnan Sivasundaram、Hanamura Ichiro、Mizuno Shohei、Kanasugi Jo、Rahman Md Lutfur、Hyodo Toshinori、Konishi Hiroyuki、Tsuzuki Shinobu、Takami Akiyoshi、Hosokawa Yoshitaka
  • 雑誌名: Cancer Letters 巻: 433 ページ: 117-130
  • DOI: 10.1016/j.canlet.2018.06.027
  • 査読あり
• [雑誌論文] Inhibition of NADPH oxidase 2 induces apoptosis in osteosarcoma: The role of reactive oxygen species in cell proliferation (2018)
  • 著者名/発表者名: Kitamoto Kazumasa、Miura Yuji、Karnan Sivasundaram、Ota Akinobu、Konishi Hiroyuki、Hosokawa Yoshitaka、Sato Keiji
  • 雑誌名: Oncology Letters 巻: 15 ページ: 7955-7962
  • DOI: 10.3892/ol.2018.8291
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Novel ATP-competitive Akt inhibitor afuresertib suppresses the proliferation of malignant pleural mesothelioma cells. (2017)
  • 著者名/発表者名: Yamaji M, Ota A, Wahiduzzaman M, Karnan S, Hyodo T, Konishi H, Tsuzuki S, Hosokawa Y, Hanyuda M.
  • 雑誌名: Cancer Med 巻: 6 号: 11 ページ: 2646-2659
  • DOI: 10.1002/cam4.1179
  • 査読あり
• [雑誌論文] Delta40p53 suppresses tumor cell proliferation and induces cellular senescence in hepatocellular carcinoma cells (2017)
  • 著者名/発表者名: Ota A, Nakao H, Sawada Y, Karnan S, Wahiduzzaman M, Inoue T, Kobayashi Y, Yamamoto T, Ishii N, Ohashi T, Nakade Y, Sato K, Itoh K, Konishi H, Hosokawa Y, Yoneda M
  • 雑誌名: J Cell Sci 巻: 130 号: 3 ページ: 614-625
  • DOI: 10.1242/jcs.190736
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] Experimental conditions permitting efficient targeted knock-in using CRISPR/Cas9 nickases (2019)
  • 著者名/発表者名: Md Lutfur Rahman, 兵頭寿典, Sivasundaram Karnan, 太田明伸, 都築忍, 細川好孝, 小西裕之
  • 学会等名: 日本ゲノム編集学会第4回大会
• [学会発表] CRISPR/Cas9 nickaseによるノックインはp53を活性化しない (2019)
  • 著者名/発表者名: 兵頭寿典, Md Lutfur Rahman, Sivasundaram Karnan, 太田明伸, 都築忍, 細川好孝, 小西裕之
  • 学会等名: 日本ゲノム編集学会第4回大会
• [学会発表] CRISPR/Cas9 nickaseによるサイレント変異不要のノックイン (2019)
  • 著者名/発表者名: 兵頭寿典, Md Lutfur Rahman, 豊田敦, Sivasundaram Karnan, 太田明伸, 都築忍, 細川好孝, 〇小西裕之
  • 学会等名: 日本ゲノム編集学会第4回大会
• [学会発表] CRISPR/Cas9を用いたNF2及びCDKN2Aノックアウトヒト中皮腫細胞株の樹立と分子生物学的解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: Sivasundaram Karnan, 太田明伸, 兵頭寿典, 小西裕之, 都築忍, 細川好孝
  • 学会等名: 第92回日本生化学会大会
• [学会発表] p16/NF2遺伝子の欠損により発現の誘導される悪性中皮腫特異的分子の同定 (2019)
  • 著者名/発表者名: Sivasundaram Karnan, 太田明伸, 花村一朗, 村上秀樹, 兵頭寿典, 小西裕之, 都築忍, 細川好孝
  • 学会等名: 第78回日本癌学会学術総会
• [学会発表] Tandem paired nicking using Cas9 nickases permits targeted knock-in without significant inhibition by p53 (2019)
  • 著者名/発表者名: Toshinori Hyodo, Md Lutfur Rahman, Atsushi Toyoda, Sivasundaram Karnan, Akinobu Ota, Shinobu Tuzuki, Yoshitaka Hosokawa, 〇Hiroyuki Konishi
  • 学会等名: Frontiers in Genome Engineering 2019
  • 国際学会
• [学会発表] DNA二重鎖切断を介さない変異ノックイン法 (2019)
  • 著者名/発表者名: 兵頭寿典, Md Lutfur Rahman, 豊田敦, Sivasundaram Karnan, 太田明伸, 都築忍, 細川好孝, 〇小西裕之
  • 学会等名: 第42回日本分子生物学会年会
• [学会発表] CRISPR/Cas9 nickaseによるサイレント変異不要のノックイン (2019)
  • 著者名/発表者名: 兵頭寿典, Md Lutfur Rahman, 豊田敦, Sivasundaram Karnan, 太田明伸, 都築忍, 細川好孝, 小西裕之
  • 学会等名: 日本ゲノム編集学会第4回大会
• [学会発表] p16/NF2遺伝子の欠損により発現の誘導される悪性中皮腫特異的分子の同定 (2018)
  • 著者名/発表者名: 2.Sivasundaram Karnan, 太田明伸, 花村一朗, 村上秀樹, Md Wahiduzzaman, 兵頭寿典, 小西裕之, 都築忍, 細川好孝
  • 学会等名: 第77回日本癌学会学術総会
• [学会発表] 多発性骨髄腫の腫瘍増殖におけるPDZ binding kinaseの関与 (2018)
  • 著者名/発表者名: 3.太田明伸, 花村一朗, Sivasundaram Karnan, 小西裕之, 都築忍, 細川好孝
  • 学会等名: 第77回日本癌学会学術総会
• [学会発表] 悪性中皮腫細胞の増殖を特異的に抑制するAkt阻害剤の探索と同定 (2018)
  • 著者名/発表者名: 4.太田明伸, 山地雅之, Md Wahiduzzaman, Sivasundaram Karnan, 兵頭寿典, 小西裕之, 都築忍, 羽生田正行, 細川好孝
  • 学会等名: 第91回日本生化学会大会
• [学会発表] Combined arsenic trioxide-cisplatin treatment synergistically suppresses proliferation of Bcr-Abl-positive leukemic cells. (2017)
  • 著者名/発表者名: Md Wahiduzzaman, Akinobu Ota, Sivasundaram Karnan, Toshinori Hyodo, Hiroyuki Konishi, Shinobu Tsuzuki, Yoshitaka Hosokawa.
  • 学会等名: 2017年度生命科学系学会合同年次大会
• [学会発表] Protein phosphatase 2Aの調節サブユニットPPP2R5Eは微小管架橋因子MTCL1の発現量を制御する. (2017)
  • 著者名/発表者名: 兵頭寿典, 稲見恵理, 太田明伸, Sivasundaram Karnan, 小西裕之, 細川好孝.
  • 学会等名: 2017年度生命科学系学会合同年次大会
• [学会発表] 悪性胸膜中皮腫の早期診断腫瘍マーカーの検討. (2017)
  • 著者名/発表者名: Sivasundaram Karnan, 太田明伸, 花村一朗, 村上秀樹, 兵頭寿典, Md Wahiduzzaman, 小西裕之, 都築忍, 細川好孝.
  • 学会等名: 2017年度生命科学系学会合同年次大会
• [学会発表] 新規Interleukin-6誘導因子PDZ binding kinaseは骨髄腫細胞の増殖と進展に関与する. (2017)
  • 著者名/発表者名: 太田明伸, 花村一朗, Sivasundaram Karnan, Md Wahiduzzaman, 兵頭寿典, 小西裕之, 都築忍, 細川好孝.
  • 学会等名: 2017年度生命科学系学会合同年次大会
• [学会発表] 花村一朗, Sivasundaram Karnan, 太田明伸, Wahiduzzaman Md, 後藤峰明, 高橋美裕希, 水野昌平, 内野かおり, 鈴木進, 都築忍, 小西裕之, 上田龍三, 細川好孝, 高見昭良. (2017)
  • 著者名/発表者名: CRISPR/Cas9を用いたFLT3-ITD導入ヒト白血病クローンの樹立と分子生物学的解析.
  • 学会等名: 第79回日本血液学会学術総会
• [学会発表] 亜ヒ酸とシスプラチンによる併用療法はBcr-Abl陽性白血病細胞に対して相乗的な増殖抑制効果を示す (2017)
  • 著者名/発表者名: 太田明伸, Md Wahiduzzaman, Sivasundaram Karnan, 兵頭寿典, 小西裕之, 都築忍, 細川好孝.
  • 学会等名: 第76回日本癌学会学術総会
• [学会発表] CRISPR/Cas9を用いたNF2ノックアウトヒト中皮腫細胞株の樹立と分子生物学的解析 (2017)
  • 著者名/発表者名: Sivasundaram Karnan, 太田明伸, 花村一朗, 村上秀樹, 兵頭寿典, Md Wahiduzzaman, 小西裕之, 都築忍, 細川好孝.
  • 学会等名: 第76回日本癌学会学術総会
• [学会発表] SINGLE-NUCLEOTIDE POLYMORPHISM IN THE PBK GENE IS CLOSELY ASSOCIATED WITH MYELOMA CELL PROLIFERATION. (2017)
  • 著者名/発表者名: Ichiro Hanamura, Akinobu Ota, Sivasundaram Karnan, Md Wahiduzzaman, Shohei Mizuno, Kaori Uchino, Jo Kanasugi, Tomohiro Horio, Satsuki Murakami, Susumu Suzuki, Ryuzo Ueda, Shinobu Tsuzuki, Hiroyuki Konishi, Yoshitaka Hosokawa, Akiyoshi Takami.
  • 学会等名: The 22nd Congress of the European Hematology Association
  • 国際学会
• [図書] ゲノム編集技術を応用した製品開発とその実用化 (2021)
  • 著者名/発表者名: 執筆者:96名、技術情報協会
  • 総ページ数: 602
  • 出版者: 技術情報協会
  • ISBN: 9784861048272