選択的オートファジーを介した転写制御機構の解明

• 研究課題/領域番号: 17K07285
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 分子生物学
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 小川 英知 大阪大学, 生命機能研究科, 特任准教授(常勤) (20370132)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2018年度)
• 配分額: 4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円); 2019年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2018年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2017年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円)
• キーワード: オートファジー / 核内複合体 / 転写制御 / タンパク質複合体 / 翻訳後修飾 / 遺伝子発現制御機構 / 転写

研究実績の概要

近年，遺伝子発現制御に重要である転写制御とタンパク質分解の分子機構であるオートファジーが密接に関与していることは明らかになりつつある。その接点として我々は選択的オートファジーのレセプターであるp62がクロマチン構造変換因子ARIP4に結合し調節することで，細胞外の状態をモニターしてクロマチン構造に反映させるエピジェネティック制御因子であることを発見した。本研究ではこのp62の核内での機能を明らかにするために，p62の核内複合体の精製およびその構成因子の機能解析を通してp62によるクロマチン構造変換およびそれに伴う転写制御機構の解明を目的とする。本年度は昨年度に引き続き，p62の核内複合体の精製によって得られた情報から核内p62に特異的に結合する複合体構成因子の相互作用の確認と，抗体作製，局在確認を行ってきた。核内p62複合体をより精製度を上げて精製するために現在グリセロール濃度勾配による分離を試みている。この手法を用いることで複数の複合体の集合体である場合，それぞれの大きさによって分離することができ，それぞれの分画から再度p62の抗体で精製することでより均一な複合体の精製が可能である。このようなアプローチと共に本年度は構成因子の一つである還元酵素であるPRDXファミリー因子群が核内p62と特異的に結合する因子であることを発見した。抗体を用いた解析で，細胞質p62複合体では非常にすくなく，核内複合体に多く含まれることが判明した。現在この因子群がp62の機能制御にどのように関与しているのか解析を進めている。p62は核内では核内小構造体を形成することが以前の観察から判明している。これらの構造体への複合体構成因子の局在を観察することで，局在と機能の関係を明らかにすると共に，クロマチンとの関与を解明していく予定である。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本年度は，p62の核内複合体の精製のため，核排出阻害剤の処理によるp62の核局在の条件を検討し効果的に核移行した状態でのp62複合体の精製に成功した。二段階精製の段階で精製度の高い複合体の取得に成功し順番に構成因子の同定を行っている。これまでに細胞質の複合体では見られない特異的な因子が数多く検出され，その中には細胞の寿命に関わる因子など，これまでまったく相互作用の知られていない因子との結合が多数検出され，来年度に行う機能解析に非常に興味深い材料がそろった状態である。このように計画にそって順調に進んでいるが，一部構成因子で同定がまだなものが存在するので順次それらについては進めていきたい。

今後の研究の推進方策

p62核内複合体のまだ未同定な構成因子が存在するために早急にの同定および，それらの確認を抗体を用いて行う。抗体は購入または受託によって作製することで，そちらに労力を取られない用にしp62複合体の機能解析に優先的に時間を使う。また既知の構成因子においては国内外にその因子の専門家がいる場合が多く，共同研究などを通じてそれらの解析に役立つ資料，資材の調達を行うことで，研究のより早い推進を図りたいと考えている。

研究成果

• [雑誌論文] Ad4BP/SF-1 regulates cholesterol synthesis to boost the production of steroids. (2018)
  • 著者名/発表者名: Takashi Baba, Hiroyuki Otake, Miki Inoue, Tetsuya Sato, Yasuhiro Ishihara, Ju-Yeon Moon, Megumi Tsuchiya, Kanako Miyabayashi, Hidesato Ogawa, Yuichi Shima, Lixiang Wang, Ryuichiro Sato, Takeshi Yamazaki, Mikita Suyama, Masatoshi Nomura, Man Ho Choi, Yasuyuki Ohkawa & Ken-ichirou Morohashi
  • 雑誌名: Communications biology 巻: 1 ページ: 18-18
  • DOI: 10.1038/s42003-018-0020-z
  • 査読あり / オープンアクセスとしている / 国際共著/国際学会である
• [雑誌論文] Shelterin promotes tethering of late replication origins to telomeres for replication-timing control. (2018)
  • 著者名/発表者名: Ogawa Shiho、Kido Sayuri、Handa Tetsuya、Ogawa Hidesato、Asakawa Haruhiko、Takahashi Tatsuro S、Nakagawa Takuro、Hiraoka Yasushi、Masukata Hisao
  • 雑誌名: EMBO Journal 巻: 37 ページ: 15-15
  • DOI: 10.15252/embj.201898997
  • 査読あり / オープンアクセスとしている
• [雑誌論文] p62/SQSTM1 promotes rapid ubiquitin conjugation to target proteins after endosome rupture during xenophagy (2018)
  • 著者名/発表者名: Tsuchiya Megumi、Ogawa Hidesato、Koujin Takako、Mori Chie、Osakada Hiroko、Kobayashi Shouhei、Hiraoka Yasushi、Haraguchi Tokuko
  • 雑誌名: FEBS Open Bio. 巻: 8 ページ: 470-480
  • DOI: 10.1002/2211-5463.12385
  • 査読あり / オープンアクセスとしている
• [雑誌論文] Ess2 bridges transcriptional regulators and spliceosomal complexes via distinct interacting domains. (2018)
  • 著者名/発表者名: Ichiro Takada, Megumi Tsuchiya, Kaori Yanaka, Shinya, Hidano, Sayuri Takahashi, Takashi Kobayashi, Hidesato Ogawa, Sinichi Nakagawa, Makoto Makishima
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 巻: 497 ページ: 597-604
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2018.02.110
  • 査読あり / オープンアクセスとしている
• [学会発表] Depletion of autophagy receptor p62/SQSTM1 enhances the efficiency of gene delivery in mammalian cells (2018)
  • 著者名/発表者名: Hidesato Ogawa, Megumi Tsuchiya, Takako Koujin, Chie Mori, Hiroko Osakada, Kento Watanabe, Shouhei Kobayashi, Yasushi Hiraoka, Tokuko Haraguchi
  • 学会等名: 第70回細胞生物第51回発生生物合同大会
• [学会発表] オートファジーレセプターp62/SQSTM1 を標的とした効果的な遺伝子導入法の確立 (2018)
  • 著者名/発表者名: 土屋 惠, 小川英知, 渡邊 賢人,荒神 尚子, 小林 昇平, 森 知栄, 小坂田 裕子, 平岡 泰, 原口 徳子
  • 学会等名: 第41回日本分子生物学会年会
• [学会発表] Depletion of autophagy receptor p62/SQSTM1 enhances the efficiency of gene delivery in mammalian cells (2017)
  • 著者名/発表者名: Hidesato Ogawa, Megumi Tsuchiya, Takako Koujin, Shouhei Kobayashi, Chie Mori, Yasushi Hiraoka, Tokuko Haraguchi
  • 学会等名: 第69回日本細胞生物学会大会
• [学会発表] Depletion of autophagy receptor p62/SQSTM1 enhances the efficiency of gene delivery in mammalian cells (2017)
  • 著者名/発表者名: Megumi Tsuchiya, Hidesato Ogawa, Takako Koujin, Shouhei Kobayashi, Chie Mori, Hiroko Osakada, Yasushi Hiraoka, Tokuko Haraguchi
  • 学会等名: 第40回日本分子生物学会年会
• [備考] 大阪大学大学院生命機能研究科細胞核ダイナミクス研究室ホームページ
  • URL: http://www.fbs.osaka-u.ac.jp/labs/hiraoka/index.html
• [備考] 大阪大学大学院 生命機能研究科 細胞ネットワーク講座 研究室ホームページ
  • URL: http://www.fbs.osaka-u.ac.jp/labs/hiraoka/member.html