高圧凍結技法と相関アレイトモグラフィーで植物細胞内膜系の３次元超微形態を捉える

• 研究課題/領域番号: 17K07477
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 形態・構造
• 研究機関: 国立研究開発法人理化学研究所
• 研究代表者: 豊岡 公徳 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 上級技師 (10360596)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2019年度)
• 配分額: 4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円); 2019年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2018年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2017年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円)
• キーワード: 高圧凍結技法 / エンドソーム / アレイトモグラフィー / 光電子相関顕微鏡 / CLEM / 電子顕微鏡 / 植物細胞 / オルガネラ / 3次元超微形態 / 細胞内輸送 / 膜交通 / ３次元超微形態 / 光電子相関顕微鏡法 / 相関アレイトモグラフィー法 / 細胞内膜系

研究成果の概要

高圧凍結技(HPF)法と光電子相関顕微鏡(CLEM)法を組み合わせた蛍光タンパク質(FP)標識オルガネラの超微形態観察法の開発を進め、植物の組織・細胞における細胞内膜系をアレイトモグラフィー(AT)法で、FP標識した細胞内膜系の微細構造を特定することを目的とした。その結果、化学固定した樹脂包埋切片中のFP標識細胞小器官を退色防止剤で蛍光回復するCLEM法を開発し、最新HPF装置で植物に適したHFP法を確立した。超薄切片を用いて高感度共焦点顕微鏡とAT搭載走査電顕と組み合わせるCLEM法を技術検討し、固定・樹脂耐性FP標識を用いることで細胞内膜系オルガネラの微細構造を捉える可能性を得た。

研究成果の学術的意義や社会的意義

CLEM法及び凍結技法は組織・細胞内の蛍光標識した超微細構造を限りなく生きた状態で可視化する技術として、これからの研究に重要である。本研究により、これら技術を発展させた。電顕メーカーとともにCLEMシステムを改良するとともに、蛍光顕微鏡や共焦点顕微鏡で試料中の蛍光を効率よく感度良く検出し、電顕で観察するために微細構造を保持する試料調製を開発した。また、最新の高圧凍結装置を用いて生物の超微形態を保持する試料調製法を確立した。これらの技術は、植物だけでなく動物や微生物など幅広い基礎研究及び応用研究に活用できると期待される。

研究成果

• [雑誌論文] Cytosolic GLUTAMINE SYNTHETASE1;1 Modulates Metabolism and Chloroplast Development in Roots (2020)
  • 著者名/発表者名: Kusano Miyako、Fukushima Atsushi、Tabuchi-Kobayashi Mayumi、Funayama Kazuhiro、Kojima Soichi、Maruyama Kyonoshin、Yamamoto Yoshiharu Y.、Nishizawa Tomoko、Kobayashi Makoto、Wakazaki Mayumi、Sato Mayuko、Toyooka Kiminori、Osanai-Kondo Kumiko、Utsumi Yoshinori、Seki Motoaki、Fukai Chihaya、Saito Kazuki、Yamaya Tomoyuki
  • 雑誌名: Plant Physiology 巻: 182 号: 4 ページ: 1894-1909
  • DOI: 10.1104/pp.19.01118
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Dimorphic Leaf Development of the Aquatic Plant Callitriche palustris L. Through Differential Cell Division and Expansion (2020)
  • 著者名/発表者名: Koga Hiroyuki、Doll Yuki、Hashimoto Kei、Toyooka Kiminori、Tsukaya Hirokazu
  • 雑誌名: Frontiers in Plant Science 巻: 11 ページ: 269-269
  • DOI: 10.3389/fpls.2020.00269
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Acclimation process of the chlorophyll <i>d</i>-bearing cyanobacterium <i>Acaryochloris marina</i> to an orange light environment revealed by transcriptomic analysis and electron microscopic observation (2020)
  • 著者名/発表者名: Kashimoto Tomonori、Miyake Keita、Sato Mayuko、Maeda Kaisei、Matsumoto Chikahiro、Ikeuchi Masahiko、Toyooka Kiminori、Watanabe Satoru、Kanesaki Yu、Narikawa Rei
  • 雑誌名: The Journal of General and Applied Microbiology 巻: 66 号: 2 ページ: 106-115
  • DOI: 10.2323/jgam.2019.11.008
  • NAID: 130007855496
  • ISSN: 0022-1260, 1349-8037
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Metabolomics with 15N Labeling for Characterizing Missing Monoterpene Indole Alkaloids in Plants (2020)
  • 著者名/発表者名: Nakabayashi Ryo、Mori Tetsuya、Takeda Noriko、Toyooka Kiminori、Sudo Hiroshi、Tsugawa Hiroshi、Saito Kazuki
  • 雑誌名: Analytical Chemistry 巻: 92 号: 8 ページ: 5670-5675
  • DOI: 10.1021/acs.analchem.9b03860
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] High Humidity Causes Abnormalities in the Process of Appressorial Formation of Blumeria graminis f. sp. hordei. (2020)
  • 著者名/発表者名: Koreyuki Sugai, Hiroshi Inoue, Chie Inoue, Mayuko Sato, Mayumi Wakazaki, Kappei Kobayashi, Masamichi Nishiguchi, Kiminori Toyooka, Naoto Yamaoka, Takashi Yaeno
  • 雑誌名: Pathogens 巻: 9 号: 1 ページ: 45-45
  • DOI: 10.3390/pathogens9010045
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Carotenoids in the eyespot apparatus are required for triggering phototaxis in Euglena gracilis (2020)
  • 著者名/発表者名: Kato Shota、Ozasa Kazunari、Maeda Mizuo、Tanno Yuri、Tamaki Shun、Higuchi‐Takeuchi Mieko、Numata Keiji、Kodama Yutaka、Sato Mayuko、Toyooka Kiminori、Shinomura Tomoko
  • 雑誌名: The Plant Journal 巻: 101 号: 5 ページ: 1091-1102
  • DOI: 10.1111/tpj.14576
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Efficient fluorescence recovery using antifade reagents in correlative light and electron microscopy (2019)
  • 著者名/発表者名: Toyooka Kiminori、Shinozaki-Narikawa Naeko
  • 雑誌名: Microscopy 巻: 68 号: 5 ページ: 417-421
  • DOI: 10.1093/jmicro/dfz029
  • 査読あり
• [雑誌論文] Alternative oxidase capacity of mitochondria in microsporophylls may function in cycad thermogenesis (2019)
  • 著者名/発表者名: Ito-Inaba Yasuko、Sato Mayuko、Sato Mitsuhiko P、Kurayama Yuya、Yamamoto Haruna、Ohata Mizuki、Ogura Yoshitoshi、Hayashi Tetsuya、Toyooka Kiminori、Inaba Takehito
  • 雑誌名: Plant Physiology 巻: 180 号: 2 ページ: 743-756
  • DOI: 10.1104/pp.19.00150
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] 3D in vivo imaging of the keratin filament network in the mouse stratum granulosum reveals profilaggrin-dependent regulation of keratin bundling (2019)
  • 著者名/発表者名: Usui Keiko、Kadono Nanako、Furuichi Yuki、Shiraga Keiichiro、Saitou Takashi、Kawasaki Hiroshi、Toyooka Kiminori、Tamura Hiroomi、Kubo Akiharu、Amagai Masayuki、Matsui Takeshi
  • 雑誌名: Journal of Dermatological Science 巻: 94 号: 3 ページ: 346-349
  • DOI: 10.1016/j.jdermsci.2019.04.006
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A Rho-actin signaling pathway shapes cell wall boundaries in Arabidopsis xylem vessels (2019)
  • 著者名/発表者名: Sugiyama Yuki、Nagashima Yoshinobu、Wakazaki Mayumi、Sato Mayuko、Toyooka Kiminori、Fukuda Hiroo、Oda Yoshihisa
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 10 号: 1 ページ: 468-468
  • DOI: 10.1038/s41467-019-08396-7
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A conserved regulatory mechanism mediates the convergent evolution of plant shoot lateral organs. (2019)
  • 著者名/発表者名: Naramoto S, Jones VAS, Nicola, N, Sato M,Toyooka K, Shimamura M, Ishida S, Nishitani K,Ishizaki K, Nishihama R, Kohchi T, Dolan L, Kyozuka J.
  • 雑誌名: PLoS Biology 巻: 17 号: 12 ページ: 12-12
  • DOI: 10.1371/journal.pbio.3000560
  • NAID: 120006813343
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] The RopGEF KARAPPO Is Essential for the Initiation of Vegetative Reproduction in Marchantia polymorpha (2019)
  • 著者名/発表者名: Hiwatashi T., Goh H., Yasui Y., Koh L.Q., Takami H., Kajikawa M., Kirita H., Kanazawa T., Minamino N., Togawa T., Sato M., Wakazaki M., Yamaguchi K., Shigenobu S., Fukaki H., Mimura T., Toyooka K., Sawa S., Yamato K.T.,Ueda T., Urano D., Kohchi T., Ishizaki K.
  • 雑誌名: Current Biology 巻: 29 号: 20 ページ: 3525-3531
  • DOI: 10.1016/j.cub.2019.08.071
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Keeping the shape of plant tissue for visualizing metabolite features in segmentation and correlation analysis of imaging mass spectrometry in Asparagus officinalis (2019)
  • 著者名/発表者名: Nakabayashi Ryo、Hashimoto Kei、Toyooka Kiminori、Saito Kazuki
  • 雑誌名: Metabolomics 巻: 15 号: 2 ページ: 24-24
  • DOI: 10.1007/s11306-019-1486-5
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Plastid gene expression is essential for lateral root stem-cell patterning, symplastic connectivity, and root plastid distribution in Arabidopsis thaliana (2018)
  • 著者名/発表者名: Nakata MT, Sato M, Wakazaki M, Sato N, Kojima K Sekine A, Nakamura S, Shikanai T, Toyooka K, Tsukaya H, Horiguchi G
  • 雑誌名: Biology Open 巻: 7 ページ: 028175-028175
  • DOI: 10.1242/bio.028175
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Stress granule formation is induced by a threshold temperature rather than a temperature difference inArabidopsis (2018)
  • 著者名/発表者名: Hamada Takahiro、Yako Mako、Minegishi Marina、Sato Mayuko、Kamei Yasuhiro、Yanagawa Yuki、Toyooka Kiminori、Watanabe Yuichiro、Hara-Nishimura Ikuko
  • 雑誌名: Journal of Cell Science 巻: 131 号: 16 ページ: 216051-216051
  • DOI: 10.1242/jcs.216051
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A whole-cell electron tomography model of vacuole biogenesis in Arabidopsis root cells (2018)
  • 著者名/発表者名: Cui Yong、Cao Wenhan、He Yilin、Zhao Qiong、Wakazaki Mayumi、Zhuang Xiaohong、Gao Jiayang、Zeng Yonglun、Gao Caiji、Ding Yu、Wong Hiu Yan、Wong Wing Shing、Lam Ham Karen、Wang Pengfei、Ueda Takashi、Rojas-Pierce Marcela、Toyooka Kiminori、Kang Byung-Ho、Jiang Liwen
  • 雑誌名: Nature Plants 巻: 5 号: 1 ページ: 95-105
  • DOI: 10.1038/s41477-018-0328-1
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Abscisic Acid Acts as a Regulator of Molecular Trafficking through Plasmodesmata in the Moss Physcomitrella patens (2018)
  • 著者名/発表者名: Kitagawa Munenori、Tomoi Takumi、Fukushima Tomoki、Sakata Yoichi、Sato Mayuko、Toyooka Kiminori、Fujita Tomomichi、Sakakibara Hitoshi
  • 雑誌名: Plant and Cell Physiology 巻: 60 号: 4 ページ: 738-751
  • DOI: 10.1093/pcp/pcy249
  • 査読あり
• [雑誌論文] A novel plasma membrane-anchored protein regulates xylem cell-wall deposition through microtubule-dependent lateral inhibition of Rho GTPase domains (2017)
  • 著者名/発表者名: Sugiyama Y, Wakazaki M, Toyooka K, Fukuda H, Oda Y
  • 雑誌名: Current Biology 巻: 27 号: 16 ページ: 2522-2528
  • DOI: 10.1016/j.cub.2017.06.059
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Ectopic colonization of oral bacteria in the intestine drives TH1 cell induction and inflammation" Ectopic colonization of oral bacteria in the intestine drives TH1 cell induction and inflammationx (2017)
  • 著者名/発表者名: Atarashi K, Suda W, Luo C, Kawaguchi T, Motoo I, Narushima S, Kiguchi Y, Yasuma K, Watanabe E, Tanoue T, Thaiss CA, Sato M, Toyooka K, Said HS, Yamagami H, Rice SA, Gevers D, Johnson RC, Segre JA, Chen K, Kolls JK, Elinav E, Morita H, Xavier RJ, Hattori M, Honda K.
  • 雑誌名: Science 巻: 358 号: 6361 ページ: 359-365
  • DOI: 10.1126/science.aan4526
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Protonema of the moss Funaria hygrometrica can function as a lead (Pb) adsorbent (2017)
  • 著者名/発表者名: Itouga M, Hayatsu M, Sato M, Tsuboi Y, Kato Y, Toyooka K, Suzuki S, Nakatsuka S, Kawakami S, Kikuchi J, Sakakibara H
  • 雑誌名: PLOS ONE 巻: 12 号: 12 ページ: e0189726-e0189726
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0189726
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The karrikin receptor KAI2 promotes drought resistance in Arabidopsis thaliana (2017)
  • 著者名/発表者名: Li W, Nguyen KH, Chu HD, Ha CV, Watanabe Y, Osakabe Y, Leyva-Gonzalez MA, Sato M, Toyooka K, Voges L, Tanaka M, Mostofa MG, Seki M, Seo M, Yamaguchi S, Nelson DC, Herrera-Estrella L, Tran LSran
  • 雑誌名: PLoS Genetics 巻: - 号: 11 ページ: e1007076-e1007076
  • DOI: 10.1371/journal.pgen.1007076
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] 植物と微生物の攻防を電子顕微鏡で捉えるには？ (2017)
  • 著者名/発表者名: 佐藤 繭子，成川-篠崎 苗子，豊岡 公徳
  • 雑誌名: 植物科学の最前線（BSJ-Review） 巻: 8 ページ: 29-35
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] 植物の免疫電子顕微鏡法 (2017)
  • 著者名/発表者名: 佐藤 繭子, 後藤 友美, 豊岡 公徳
  • 雑誌名: 顕微鏡 巻: 52 ページ: 98-103
  • NAID: 130007689216
  • 査読あり
• [学会発表] Development of rapid and accurate CLEM system and application for tissues and cells of plant and animal (2020)
  • 著者名/発表者名: Kiminori Toyooka
  • 学会等名: 3D Electron Microscopy of Organelles and Macromolecules (EMOM)
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 光-電子相関顕微鏡システムの開発と生物試料への応用 (2020)
  • 著者名/発表者名: 豊岡 公徳
  • 学会等名: 第125回日本解剖学会総会・全国学術集会
  • 招待講演
• [学会発表] 切片SEM観察法の植物試料への応用 (2019)
  • 著者名/発表者名: 豊岡 公徳
  • 学会等名: 日本顕微鏡学会第75回学術講演会
• [学会発表] Fluorescence Detection of Fluorescence-labeled Organelles In-resin Section using Antifade Reagents in Correlative Light and Electron Microscopy (2019)
  • 著者名/発表者名: Kiminori Toyooka
  • 学会等名: Microscopy & Microanalysis 2019 Meeting
  • 国際学会
• [学会発表] 走査電顕を用いた組織・細胞の新しい捉え方 (2019)
  • 著者名/発表者名: 豊岡 公徳
  • 学会等名: 日本植物学会第83回大会
• [学会発表] 植物試料切片を用いたYAG-BSE走査電顕観察法の検討 (2019)
  • 著者名/発表者名: 佐藤繭子、若崎眞由美、宮彩子、武田紀子、豊岡公徳
  • 学会等名: 日本顕微鏡学会 第43回関東支部講演会
• [学会発表] 光電子相関顕微鏡法を用いた植物メリステムの形態観察 (2018)
  • 著者名/発表者名: 宮彩子、佐藤繭子、成川苗子、前田躍、許斐麻美、星野吉延、豊岡公徳
  • 学会等名: 日本顕微鏡学会第74回学術講演会
• [学会発表] シロイヌナズナ根端分裂組織のQCの形態的特徴 (2018)
  • 著者名/発表者名: 宮彩子、佐藤繭子、若崎眞由美、豊岡公徳
  • 学会等名: 日本植物形態学会 第29回大会
• [学会発表] 高分解能走査電顕を用いた細胞内小器官の光電子相関顕微鏡解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 豊岡公徳, 成川苗子,宮彩子,佐藤繭子,前田躍,許斐麻美,星野吉延
  • 学会等名: 第74回日本顕微鏡学会総会・学術講演会
• [学会発表] 光-電子相関顕微鏡法(CLEM):再生医療研究への応用に向けて (2018)
  • 著者名/発表者名: 豊岡公徳
  • 学会等名: 第74回日本顕微鏡学会総会・学術講演会
• [学会発表] メリステムの超微形態を光電子相関顕微鏡法を用いて捉える (2018)
  • 著者名/発表者名: 宮彩子、佐藤繭子、齋藤夕子、前田躍、許斐麻美、星野吉延、豊岡公徳
  • 学会等名: 日本植物学会第82回大会
• [学会発表] 高圧凍結技法を用いた藻類・植物の電子顕微鏡解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 佐藤繭子, 豊岡公徳
  • 学会等名: 日本植物学会第82回大会
• [学会発表] Development of rapid and accurate correlative light and electron microscopy for fluorescence-labeled organelles using light microscopes and FE-SEM (2018)
  • 著者名/発表者名: Kiminori Toyooka, Naeko Narikawa, Ayako Miya, Mayuko Sato, Yaku Maeda, Mami Konomi, Yoshinobu Hoshino
  • 学会等名: 19th International Microscopy Congress (IMC19)
  • 国際学会
• [学会発表] Development of rapid and accurate correlative light and electron microscopy for fluorescence-labeled organelles using FE-SEM (2018)
  • 著者名/発表者名: Kiminori Toyooka
  • 学会等名: 広島大学理学部主催国際シンポジウム
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 光電子相関顕微鏡法の開発とその応用：蛍光タンパク質の局在をFE-SEMで捉える (2017)
  • 著者名/発表者名: 豊岡公徳
  • 学会等名: 第147回電子顕微鏡技術研究会
  • 招待講演
• [学会発表] 生物試料の光電子相関顕微鏡法：光顕で観察した同一切片をFE-SEMで捉える (2017)
  • 著者名/発表者名: 豊岡公徳, 成川苗子, 佐藤繭子, 前田躍, 羽根田茂, 星野吉延, 許斐麻美, 川俣茂
  • 学会等名: 日本顕微鏡学会第73回学術講演会
• [学会発表] シロイヌナズナ根端における ERボディ様構造体の超微形態解析 (2017)
  • 著者名/発表者名: 橋本恵, 成川苗子, 佐藤繭子, 岡本龍史, 豊岡公徳
  • 学会等名: 日本植物学会第81回大会
• [学会発表] Effective Detection of Fluorescence-labeled Plant Organelles in Resin Section using MirrorCLEM with FE-SEM (2017)
  • 著者名/発表者名: Toyooka K., Narikawa N., Sato M., Maeda Y., Haneda S., Hoshino Y., Konomi M.,Kawamata K.
  • 学会等名: M&M 2017 Microscopy & MicroAnalysis
  • 国際学会
• [学会発表] 光電子相関顕微鏡法（CLEM）の基礎と応用 (2017)
  • 著者名/発表者名: 豊岡公徳
  • 学会等名: 日本顕微鏡学会 SEM分科会主催SCANTECH2017
  • 招待講演
• [学会発表] 樹脂包埋組織切片中のGFP蛍光を捉える効果的な光電子相関顕微鏡法の検討 (2017)
  • 著者名/発表者名: 豊岡公徳, 成川苗子, 佐藤繭子, 前田躍, 羽根田茂, 許斐麻美, 川俣茂, 星野吉延
  • 学会等名: 日本顕微鏡学会第60回記念シンポジウム
• [備考] 理化学研究所 環境資源科学研究センター 質量分析・顕微鏡解析ユニット 顕微鏡施設
  • URL: http://bioem.riken.jp
• [備考] 理研CSRS 質量分析・顕微鏡解析ユニット 顕微鏡解析室
  • URL: http://bioem.riken.jp
• [備考] 鉛吸着材に使えるコケの新たな生物機能を発見
  • URL: http://www.riken.jp/pr/press/2018/20180117_1/
• [備考] 口腔常在菌の中には、 異所性に腸管に定着すると免疫を活性化するものがいる
  • URL: https://www.keio.ac.jp/ja/press-releases/files/2017/10/20/171020-1.pdf
• [備考] セルロース合成の”足場”増やす遺伝子を発見
  • URL: https://www.nig.ac.jp/nig/ja/2017/08/research-highlights_ja/20170811.html
• [産業財産権] アライメントシステム及び位置合わせ用シール (2018)
  • 発明者名: 前田躍・星野吉延・豊岡公徳
  • 権利者名: 前田躍・星野吉延・豊岡公徳
  • 産業財産権種類: 特許
  • 出願年月日: 2018