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生殖細胞欠損胚を用いた、効率的なキメラ生産技術について

研究課題

研究課題/領域番号 17K15359
研究種目

若手研究(B)

配分区分基金
研究分野 動物生産科学
研究機関山梨大学

研究代表者

長友 啓明  山梨大学, 大学院総合研究部, 特任助教 (30746813)

研究期間 (年度) 2017-04-01 – 2020-03-31
研究課題ステータス 交付 (2018年度)
配分額 *注記
4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)
2018年度: 2,340千円 (直接経費: 1,800千円、間接経費: 540千円)
2017年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
キーワードゲノム編集 / 始原生殖細胞 / 胚移植 / キメラ個体 / 発生 / キメラ技術 / 胚操作
研究実績の概要

次世代に目的の遺伝子を残す技術は有用であり、医療、家畜生産や、希少動物や絶滅危惧種の増殖維持の側面からも重要である。目的の子孫を増産させる方法の一つとして、キメラ技術がある。キメラ技術は複数の手法が確立されており、受精卵キメラや四倍体胚を用いた、胚盤胞補完法が代表的であり、目的の細胞の遺伝情報を受け継ぐことが可能であるが、生殖細胞まで寄与する割合はあまり高くないことや、産仔率が低いといった問題がある。そこで、本研究では直接受精卵で生殖細胞欠損胚を作出することで、通常胚キメラと比較し、目的細胞の生殖細胞への寄与率改善を目指す。平成29年度は、生殖細胞を欠損させるために始原生殖細胞形成初期から発現するPrdm14をターゲットとして決定した。guide RNAを複数設計し受精卵前核へ注 入後、移植し産仔を解析すると、ホモで欠損している個体を確認でき、精巣を16週齢で摘出すると、同齢の野生型と比較し明らかにサイズが小さくなり、また精 巣内および精巣上体尾部中に精子は無く、生殖細胞が完全に欠損していることが確認できた。また、Prdm14遺伝子のヘテロ欠損個体において、野生型と比較して 顕著に精巣のサイズが小さくなっており、ヘテロ欠損であっても、キメラにおける目的細胞の寄与効率が上昇することが期待される結果であった。平成30年度は、29年度に生殖細胞を欠損させるためにターゲットとして決定した、始原生殖細胞形成初期から発現するPrdm14について4種のguide RNAを設計し、ノックアウト効率を調査した。その結果4種同時に注入することで、ホモおよびヘテロノックアウト個体を約30-60%の効率で作製可能であった。さらに、蛍光マーカーを有するトランスジェニックES細胞を作製し、キメラ個体作製を試み、生殖細胞への寄与率とPrdm14 KO個体との関係性を調査した。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

前核注入によるPrdm14 KO個体作製について、5割を超える効率を達成でき、順調に作製できた。しかしながら、蛍光マーカーを有するES細胞とのキメラ個体を作製する際に、コントロールとしての野生型受精卵とのキメラでさえもES細胞の寄与率が高く、ほぼ全身に寄与するES細胞であった。本研究では比較的緩やかな寄与率のES細胞を用いないと、生殖細胞への寄与率の比較が難しいため、現在ES細胞の継代数を増やす等の工夫をし、緩やかな寄与率のES細胞を作製している。また、ラットES細胞との異種間キメラも試みる。

今後の研究の推進方策

寄与率の低いES細胞を作製する方法を検討している。本研究では比較的緩やかな寄与率のES細胞を用いないと、生殖細胞への寄与率の比較が難しいため、現在ES細胞の継代数を増やす等の工夫をし、緩やかな寄与率のES細胞を作製している。また、寄与率が低いことが想定されるラットES細胞との異種間キメラも試みる。

報告書

(2件)
  • 2018 実施状況報告書
  • 2017 実施状況報告書

研究成果

(12件)

すべて 2018 2017

すべて 雑誌論文 学会発表

  • [雑誌論文] Platelets play an essential role in murine lung development through Clec-2/podoplanin interaction2018

    • 著者名/発表者名
      Tsukiji Nagaharu、Inoue Osamu、Morimoto Mitsuru、Tatsumi Norifumi、Nagatomo Hiroaki、Ueta Koji、Shirai Toshiaki、Sasaki Tomoyuki、Otake Shimon、Tamura Shogo、Tachibana Toshiaki、Okabe Masataka、Hirashima Masanori、Ozaki Yukio、Suzuki-Inoue Katsue
    • 雑誌名

      Blood

      巻: 132 ページ: 1167-1179

    • DOI

      10.1182/blood-2017-12-823369

    • NAID

      130007689108

    • 関連する報告書
      2018 実施状況報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Reciprocal regulation of TEAD4 and CCN2 for the trophectoderm development of the bovine blastocyst2018

    • 著者名/発表者名
      Akizawa H., Kobayashi K., Bai H., Takahashi M., Kagawa S., Nagatomo H. and Kawahara M.
    • 雑誌名

      Reproduction

      巻: IN PRESS ページ: 563-571

    • DOI

      10.1530/rep-18-0043

    • 関連する報告書
      2018 実施状況報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Agarose capsules as new tools for protecting denuded mouse oocytes/embryos during handling and freezing-thawing and supporting embryonic development in vivo2017

    • 著者名/発表者名
      Nagatomo H, Yao T, Araki Y, Mizutani E, Wakayama T.
    • 雑誌名

      Sci Rep.

      巻: 7 ページ: 17960-17960

    • DOI

      10.1038/s41598-017-18365-z

    • 関連する報告書
      2017 実施状況報告書
    • 査読あり / オープンアクセスとしている
  • [雑誌論文] Production of cloned mice using oocytes derived from ICR-outbred strain2017

    • 著者名/発表者名
      Tanabe Y, Kuwayama H, Wakayama S, Nagatomo H, Ooga M, Kamimura S, Kishigami S, Wakayama T.
    • 雑誌名

      Reproduction

      巻: 154(6) ページ: 859-866

    • DOI

      10.1530/rep-17-0372

    • 関連する報告書
      2017 実施状況報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Healthy offspring from freeze-dried mouse spermatozoa held on the International Space Station for 9 months.2017

    • 著者名/発表者名
      Sayaka Wakayama, Yuko Kamada, Kaori Yamanaka, Takashi Kohda, Hiromi Suzuki, Toru Shimazu,
    • 雑誌名

      Proc Natl Acad Sci USA

      巻: 1 ページ: 201701425-201701425

    • DOI

      10.1073/pnas.1701425114

    • 関連する報告書
      2017 実施状況報告書
    • 査読あり / オープンアクセスとしている
  • [雑誌論文] The Number of Point Mutations in Induced Pluripotent Stem Cells and Nuclear Transfer Embryonic Stem Cells Depends on the Method and Somatic Cell Type Used for Their Generation.2017

    • 著者名/発表者名
      Araki R, Mizutani E, Hoki Y, Sunayama M, Wakayama S, Nagatomo H, Kasama Y, Nakamura M, Wakayama T, Abe M.
    • 雑誌名

      Stem Cells

      巻: 35 ページ: 1189-1196

    • DOI

      10.1002/stem.2601

    • 関連する報告書
      2017 実施状況報告書
    • 査読あり / オープンアクセスとしている / 謝辞記載あり
  • [学会発表] 色体分配異常を起こしたマウス受精胚における異常染色体の回収と同定の試み2018

    • 著者名/発表者名
      柴﨑 郁江・鎌田 裕子・長友 啓明・大我 政敏・若山 照彦
    • 学会等名
      第59回日本卵子学会
    • 関連する報告書
      2018 実施状況報告書
  • [学会発表] 種の PLC ζで活性化させたマウス卵子の発生能2018

    • 著者名/発表者名
      山本 悠ノ介・廣瀬 直樹・大 我 正敏・上 村 悟氏・長 友 啓明・若山さやか・伊 藤 潤哉・若 山 照彦
    • 学会等名
      第59回日本卵子学会
    • 関連する報告書
      2018 実施状況報告書
  • [学会発表] Agarose capsules as new tools for protecting denuded mouse oocytes/embryos during handling and freezing-thawing and supporting embryonic development in vivo2017

    • 著者名/発表者名
      Hiroaki Nagatomo, Tatsuma Yao, Yasuyuki Araki, Eiji Mizutani, Teruhiko Wakayama
    • 学会等名
      World Congress of Reproductive Biology 2017
    • 関連する報告書
      2017 実施状況報告書
    • 国際共著/国際学会である
  • [学会発表] Healthy offspring from freeze-dried mouse spermatozoa held on the International Space Station for 9 months.2017

    • 著者名/発表者名
      Wakayama S, Kamada Y, Yamanaka K, Kohda T, Suzuki H, Shimazu T, Tada MN, Osada I, Nagamatsu A, Kamimura S, Nagatomo H, Mizutani E, Ishino F, Yano S, Wakayama T.
    • 学会等名
      World Congress of Reproductive Biology 2017
    • 関連する報告書
      2017 実施状況報告書
    • 国際共著/国際学会である
  • [学会発表] Developmental competence of mouse oocyte activeted by different species of PLCζ2017

    • 著者名/発表者名
      Yamamoto Y, Ooga M, Kamimura S, Nagatomo H, Wakayama S, Ito J, Wakayama T
    • 学会等名
      World Congress of Reproductive Biology 2017
    • 関連する報告書
      2017 実施状況報告書
    • 国際共著/国際学会である
  • [学会発表] Samo E, Nagatomo H, Ooga M, Kamimura S, Wakayama S, Kishigami S, Wakayama T2017

    • 著者名/発表者名
      Detailed strain specific difference on fertilization process by mouse ICSI
    • 学会等名
      World Congress of Reproductive Biology 2017
    • 関連する報告書
      2017 実施状況報告書
    • 国際共著/国際学会である

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公開日: 2017-04-28   更新日: 2019-12-27  

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