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NMRを用いた生体機能分子-標的蛋白質複合体の相互作用解析法の開発

研究課題

研究課題/領域番号 18032021
研究種目

特定領域研究

配分区分補助金
審査区分 理工系
研究機関東京大学

研究代表者

坂倉 正義  東京大学, 大学院・薬学系研究科, 助教 (20334336)

研究分担者 嶋田 一夫  東京大学, 大学院・薬学系研究科, 教授 (70196476)
研究期間 (年度) 2006 – 2007
研究課題ステータス 完了 (2007年度)
配分額 *注記
4,200千円 (直接経費: 4,200千円)
2007年度: 2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
2006年度: 2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
キーワード核磁気共鳴法 / 蛋白質 / 相互作用解析 / 常磁性 / ユビキチン
研究概要

既存の分子を超える高機能性分子を設計するためには、リガンド分子が標的蛋白質のどの部位と相互作用しているかを、原子レベルで理解する必要がある。本研究は、蛋白質上のリガンド結合部位を原子レベルにおいて同定することを目的として、常磁性分子が蛋白質表面の13C核に対して誘起する常磁性シフトを利用した、新規NMR相互作用解析法の開発を行った。本年度は、常磁性シフトを利用した相互作用界面決定法の適用範囲の拡張について検討を行った。
(1)相互作用系の親和性(親和性の弱い複合体についても相互作用界面を決定できるか?)
単独状態のubiquitinと、YUH(wt)結合状態のubiquitin(結合定数1.3×10e5 M-1)のそれぞれに対してTEMPOLを添加し、YUH(wt)結合に伴う常磁性シフトの変化を測定した。この結果、ubiquitinのT7-Cb,Cg,T9-Cg,I44-Cg2,Cd,V70-Cb,Cg1,Cg2,L71-Cb,Cd1,L73-Cd1について、YUH(wt)結合に伴う0.05ppm以上の常磁性シフトの減少が観測された。これらの原子の分布域は、ubiquitin-YUH(C90S)(結合定数2.2×10e7M-1)の常磁性シフト解析において検出された相互作用界面原子の分布域と一致していた。以上より、常磁性シフトを利用した相互作用界面決定法が、NMRの時間領域において速い交換状態である、結合定数として10e5[M-1]程度の親和性の相互作用系に対して適用可能であると結論した。
(2)相互作用系の分子量(膜蛋白質などの巨大分子についても相互作用界面を決定できるか?)(坂倉)
カリウムチャネルであるKcsA(みかけの分子量>100KDa)に対して安定同位体標識を導入し、一連の3重共鳴測定を行うことにより、KcsAの主鎖NHに由来するシグナルの帰属を試みた。また、Kayらによって開発された手法(Tugarinov and Kay,2005)を用いることによりメチル基に対して選択的に安定同位体標識を行い、KcsAのメチル基に由来するシグナルを高感度に観測することに成功した。

報告書

(2件)
  • 2007 実績報告書
  • 2006 実績報告書
  • 研究成果

    (11件)

すべて 2008 2007 2006 その他

すべて 雑誌論文 (8件) (うち査読あり 3件) 学会発表 (2件) 備考 (1件)

  • [雑誌論文] The amino acids involved in the distinct carbohydrate specificities between macrophage galactose-type C-type lectins 1 and 2(CD301a and b)of mice.2008

    • 著者名/発表者名
      Oo-Puthinan Sarawut
    • 雑誌名

      Biochim. Biophys. Acta. 1780

      ページ: 89-100

    • 関連する報告書
      2007 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Thermodynamic and structural basis for transition-state stabilization in antibody-catalyzed hydrolysis.2007

    • 著者名/発表者名
      Masayuki Oda
    • 雑誌名

      J. Mol. Biol. 369

      ページ: 198-209

    • 関連する報告書
      2007 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Identification and characterization of the slowly exchanging pH-dependent conformational rearrangement in KcsA.2007

    • 著者名/発表者名
      Ko Takeuchi
    • 雑誌名

      J. Biol. Chem. 282

      ページ: 15179-15186

    • 関連する報告書
      2007 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Structural basis of the transition-state stabilization in antibody-catalyzed hydrolysis2007

    • 著者名/発表者名
      Masayoshi Sakakura
    • 雑誌名

      J. Mol. Biol. 367

      ページ: 133-147

    • 関連する報告書
      2006 実績報告書
  • [雑誌論文] Pairwise NMR experiments for the determination of protein backbone dihedral angle Phi based on cross-correlated spin relaxation.2007

    • 著者名/発表者名
      Hideo Takahashi
    • 雑誌名

      J.Biomol.NMR 37

      ページ: 179-185

    • 関連する報告書
      2006 実績報告書
  • [雑誌論文] Ligand-induced structural changes of the CD44 hyaluronan-binding domain revealed by NMR2006

    • 著者名/発表者名
      Mitsuhiro Takeda
    • 雑誌名

      J.Biol.Chem. 281

      ページ: 40089-40095

    • 関連する報告書
      2006 実績報告書
  • [雑誌論文] Utilization of methyl proton resonances in cross-saturation measurement for determining the interfaces of large protein-protein complexes.2006

    • 著者名/発表者名
      Hideo Takahashi
    • 雑誌名

      J.Biomol.NMR 34

      ページ: 167-177

    • 関連する報告書
      2006 実績報告書
  • [雑誌論文] Rapid preparation of stable isotope labeled peptides that bind to target proteins by a phage library system.2006

    • 著者名/発表者名
      Yumiko Mizukoshi
    • 雑誌名

      J.Biomol.NMR 34

      ページ: 23-30

    • 関連する報告書
      2006 実績報告書
  • [学会発表] 常磁性シフトと立体整列同位体標識を利用した、タンパク質間相互作用解析法の開発2008

    • 著者名/発表者名
      徳永 裕二
    • 学会等名
      日本薬学会
    • 発表場所
      横浜(パシフィコ横浜)
    • 年月日
      2008-03-28
    • 関連する報告書
      2007 実績報告書
  • [学会発表] An NMR Method for the Determination of Protein Binding Interfaces using TEMPOL-induced Chemical Shift Perturbations2007

    • 著者名/発表者名
      坂倉 正義
    • 学会等名
      ISMAR 2007
    • 発表場所
      Kenting, Taiwan
    • 年月日
      2007-10-18
    • 関連する報告書
      2007 実績報告書
  • [備考]

    • URL

      http://ishimada.f.u-tokyo.ac.jp/public_html/

    • 関連する報告書
      2007 実績報告書

URL: 

公開日: 2006-04-01   更新日: 2018-03-28  

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