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1細胞内生体分子の定量法の開発

研究課題

研究課題/領域番号 18038047
研究種目

特定領域研究

配分区分補助金
審査区分 理工系
研究機関(財)東京都医学研究機構

研究代表者

原田 慶恵  (財)東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 副参事研究員 (10202269)

研究分担者 横田 浩章  (財)東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 主任研究員 (90415547)
研究期間 (年度) 2006
研究課題ステータス 完了 (2006年度)
配分額 *注記
1,400千円 (直接経費: 1,400千円)
2006年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円)
キーワード全反射顕微鏡 / マイクロアレイ / マイクロビーズ / 生体分子
研究概要

1細胞中に存在する酵素の活性を計測する技術の開発を行った。まず、多数の凹(40×40×20μm^3)のあるPDMSマイクロチャンバーチップ上に細胞をまき、凹部に細胞を収めた後、ペプチドのC端に蛍光色素を結合させたFluorogenic基質を細胞溶解液と共に流し込み、カバーガラスを載せ、PDMSチップをガラス面に圧着し、約30pLの微小空間に細胞を閉じこめた。Fluorogenic基質はそのままでは蛍光を発しないが、酵素によってペプチドと蛍光色素の間で切断されると蛍光色素が放出され、蛍光を発する。細胞がチャンバー内で溶解され、細胞内の酵素が溶出すると、酵素が基質の切断を開始し、蛍光シグナルが時間とともに増加していく。蛍光強度の時間変化から、1個の細胞に含まれていた酵素の分子数を推定することができる。ラットPC12細胞のCa2+依存性プロテアーゼであるカルパインを1細胞レベルで計測すると、Ca2+存在下では、基質であるSuc-LLVY-MCAが分解され、蛍光分子(AMC)が放出され、チャンバー内の蛍光強度が時間と共に増加した。一方、EDTAでCa2+をキレートするとこの活性は、ほとんど認められなかった。また、カルパイン阻害剤であるZLLHやカルパスタチンを添加すると、Ca2+存在下でも完全に活性は抑制されていることを確認した。次に、アポトーシスを起こした細胞で活性が上昇することが知られているカスパーゼ活性を、個々の細胞でカスパーゼのFluorogenic基質を用いて調べた。培養液から血清を抜き、アポトーシスを誘導した細胞と、通常の血清を含む培地で、培養した細胞で測定し比較した。その結果、アポトーシスを誘導した細胞の中にはカスパーゼ活性が高い細胞が存在した。カスパーゼ活性が高い細胞が本当にアポトーシスを起こしているかどうかを確認することが、今後の課題である。

報告書

(1件)
  • 2006 実績報告書
  • 研究成果

    (8件)

すべて 2007 2006 2003

すべて 雑誌論文 (6件) 図書 (2件)

  • [雑誌論文] Inhibition of Reversed Electron Transfer and Proton Transport in the Beef Heart Cytochrome bcl Complex by Chemical Modification.2007

    • 著者名/発表者名
      Miki, T.
    • 雑誌名

      J. Biochem. 141・3

      ページ: 377-387

    • 関連する報告書
      2006 実績報告書
  • [雑誌論文] Dynamic polymorphism of Ras observed by single molecule FRET is the basis for molecular recognition.2006

    • 著者名/発表者名
      Arai Y.
    • 雑誌名

      Biochem. Biophys. Res. Commun. 343・3

      ページ: 809-815

    • 関連する報告書
      2006 実績報告書
  • [雑誌論文] 1分子蛍光測定におけるブリンキングの問題2006

    • 著者名/発表者名
      横田浩章
    • 雑誌名

      生物物理 46・3

      ページ: 164-168

    • NAID

      110004750173

    • 関連する報告書
      2006 実績報告書
  • [雑誌論文] Direct observation of DNA rotation during branchmigration of Holliday junction DNA by Escherichia coli RuvA-RuvB protein complex.2006

    • 著者名/発表者名
      Han, Y-W.
    • 雑誌名

      Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103・31

      ページ: 11544-11548

    • 関連する報告書
      2006 実績報告書
  • [雑誌論文] バイオマシン・生物分子モーター2006

    • 著者名/発表者名
      原田慶恵
    • 雑誌名

      細胞工学 25・8

      ページ: 878-883

    • 関連する報告書
      2006 実績報告書
  • [雑誌論文] Visualization of RecA filaments and DNA by fluorescence microscopy.2003

    • 著者名/発表者名
      Nishinaka, T.
    • 雑誌名

      J. Biochem. 141・2

    • 関連する報告書
      2006 実績報告書
  • [図書] ナノバイオ辞典 一分子観察, 蛍光顕微鏡, 蛍光色素, 光ピンセット2007

    • 著者名/発表者名
      原田慶恵
    • 総ページ数
      10
    • 出版者
      テクノシステム
    • 関連する報告書
      2006 実績報告書
  • [図書] DNA, RNA ポリメラーゼ. 生物物理学ハンドブック2007

    • 著者名/発表者名
      原田慶恵
    • 出版者
      朝倉書店(印刷中)
    • 関連する報告書
      2006 実績報告書

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公開日: 2006-04-01   更新日: 2018-03-28  

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