| 研究概要 |
動物の神経内分泌小胞にはcytochrome b561を中心とする膜貫通電子伝達系が存在し,細胞質のアスコルビン酸(AsA)から小胞内の銅含有酸素添加酵素への電子伝達を媒介している。この反応は小胞内での神経伝達物質合成反応に必須である。本研究では、脳神経内分泌組織に特異的な電子伝達・酵素反応系の構造と機能,そして小胞の輸送・融合現象・開口放出の解明するため,多機能プロテオリポソームを使ったアプローチを行う。人工小胞膜および内側に膜酵素・膜タンパク質を埋め込んだプロテオリポソームを作製し,小胞外からは基質・神経ペプチドをTAドメインを利用した輸送系で,電子当量はb561により供給して,小胞内で神経伝達物質の合成を行わせ,特異的な電子伝達系・酵素反応系の構造と機能を解明する。
本年度は、次のような段階的な実験・解析を行った。(1)安定プロテオリポソームの作製技術の完成:AsA,野生型b5からなるプロテオリポソームを構築するための条件検索。(2)TAドメインを用いたプロテオリポソーム内腔への物質輸送系の構築:ヒトb5のTAドメインのリボソーム膜への結合とリボソーム内腔への自立的移動による輸送系を構築することを目指して、TAドメインに種々の変異・延長を導入したb5変異体を大腸菌で発現させる系を構築し,その発現・精製に成功した。(3)b561によるAsA依存性膜貫通電子伝達反応機構を解明するために,植物トウモロコシ由来b561を酵母Pichia pastorisにおいて大量発現させる系を構築し,野生型とAsA結合部位,MDA結合部位周辺での特異的変異体を精製して種々の酵素的・タンパク質化学的測定を行った。その結果,植物b561でも動物b561と同様な機構に基づくAsA由来電子伝達反応が機能していることが明らかとなった。
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