| 研究概要 |
本研究では水素分子の酸化を可逆的に触媒するヒドロゲナーゼのNiFeクラスター活性中心形成過程に関与する,HypEとHypFが触媒するカルバモイルリン酸からニトリル基を合成する反応機構の解明を目指している.昨年度までは,硫酸還元菌Desulfovibrio vulgaris Hildenborough由来のタンパク質試料を用いて実験を行い,ヌクレオチド結合型,非結合型それぞれにおいてHypE単体の結晶構造決定に成功していたが,活性のあるHypFタンパク質試料の調整が困難であることが判明していた.そこで今年度は,大腸菌由来HypE,HypFタンパク質の調整を試みた.アフィニティークロマトグラフィー等による精製後のタンパク質は硫酸還元菌由来のものとは異なり,両者の間には有意な相互作用が見られ,さらにHypFによるHypEへのカルバモイル化反応も確認できた.HypEF複合体をゲルろ過カラムクロマトグラフィー等の手法により分析したところ,(HypE)_2(HypF)_2の量比を示唆する結果が得られ,高純度の複合体試料を得ることに成功している.また,全長HypF単体の結晶化は困難であることがこれまでに分かっているため,結晶化に適したコンストラクト作製にも着手しており,その結果,幾つかの有力な発現系が得られた.これらの発現系は,結晶化だけでなく,HypEとHypFの相互作用様式および反応機構の解明にも大いに役立つことが期待される.
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