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膜電位-細胞長変換素子プレスチンの分子構築と動的構造変化

研究課題

研究課題/領域番号 18059033
研究種目

特定領域研究

配分区分補助金
審査区分 生物系
研究機関生理学研究所

研究代表者

久保 義弘  生理学研究所, 分子生理研究系, 教授 (80211887)

研究期間 (年度) 2006 – 2007
研究課題ステータス 完了 (2007年度)
配分額 *注記
9,700千円 (直接経費: 9,700千円)
2007年度: 4,900千円 (直接経費: 4,900千円)
2006年度: 4,800千円 (直接経費: 4,800千円)
キーワード生理学 / 神経科学 / 生体分子 / 蛋白質 / シグナル伝達
研究概要

今年度、以下の成果を得た。(1)プレスチンに結合する蛋白分子を同定する目的で、yeastを用いたtwo hybrid法による検索を行った。プレスチンが内耳の外遊毛細胞に強く発現していることを念頭において、脳全体ではなく、蝸牛器官から微量のpolyA(+)RNAを抽出し、cDNAライブラリーを作成した。スクリーニングの結果、いくつかの候補分子を同定した。(2)単粒子構造解析を目指し、Baculo virus Sf9細胞発現系を用いてFLAG tagを付加したプレスチン全蛋白を発現させ、その膜画分をdodecyl beta-maltosideを用いて可溶化し、FLAG affinity columnおよび、ゲルろ過カラムを用いて精製した。ゲルろ過の結果、および、非変性ゲル電気泳動の結果から、4量体であることが示された。最終精製蛋白を、酢酸ウランによる負染色の後に電顕撮影し、得られた13,000個の画像データを元に、種々の角度から見た平均2次元画像の取得と3次元投射画像の再構築を行った。最終的に、4方対称の77x77x115Aの弾丸状の構造をしていること、抗体の結合位置から、弾尻が細胞内側に位置することが明らかになった。(3)C末端細胞内領域に蛍光蛋白CFPもしくはYFPを付加したコンストラクトを共発現させ、FRET解析を行った。
Bathに高K+液を投与することにより細胞を脱分極させたところ、FRETの減少が観察された。

報告書

(2件)
  • 2007 実績報告書
  • 2006 実績報告書
  • 研究成果

    (6件)

すべて 2008 2007 2006

すべて 雑誌論文 (6件) (うち査読あり 2件)

  • [雑誌論文] The motor protein prestin is a bullet-shaped molecule with inner Cavities.2008

    • 著者名/発表者名
      Mio K, Kubo Y, Ogura T, Yamamoto T, Arisaka F and Sato C
    • 雑誌名

      Journal of Biological Chemistry 283

      ページ: 1137-1145

    • 関連する報告書
      2007 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] KCNE1 and KCNE3 Stabilize and/or Slow Vbltage Sensing S4 Segment of KCNQ1 Channel.2007

    • 著者名/発表者名
      Nakajo K and Kubo Y
    • 雑誌名

      Journal of General Physiology 130

      ページ: 269-281

    • 関連する報告書
      2007 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Coupling profile of the metabotropic glutamate receptor 1□ is regulated by the C-terminal domain.2007

    • 著者名/発表者名
      Tateyama, M., Kubo, Y.
    • 雑誌名

      Molecular and Cellular Neuroscience 34

      ページ: 445-452

    • 関連する報告書
      2006 実績報告書
  • [雑誌論文] Alternative splicing of RGS8 gene changes the binding property to the M1 muscarinic receptor to confer receptor type-specific Gq regulation.2006

    • 著者名/発表者名
      Itoh, M., Nagatomo, K., Kubo, Y., Saitoh.O.
    • 雑誌名

      Journal of Neurochemistry 99

      ページ: 1505-1516

    • 関連する報告書
      2006 実績報告書
  • [雑誌論文] Regulation of the desensitization and ion selectivity of ATP-gated P2X_2 channels by phosphoinositides.2006

    • 著者名/発表者名
      Fujiwara, Y., Kubo, Y.
    • 雑誌名

      Journal of Physiology 576

      ページ: 135-149

    • 関連する報告書
      2006 実績報告書
  • [雑誌論文] Functional roles of charged amino acid residues on the wall of the cytoplasmic pore of Kir2.1.2006

    • 著者名/発表者名
      Fujiwara, Y., Kubo, Y.
    • 雑誌名

      Journal of General Physiology 127

      ページ: 401-419

    • 関連する報告書
      2006 実績報告書

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公開日: 2006-04-01   更新日: 2018-03-28  

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