ナイロンオリゴマー分解酵素の立体構造解析と人工アミド合成への応用

• 研究課題/領域番号: 18360400
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 生物機能・バイオプロセス
• 研究機関: 兵庫県立大学
• 研究代表者: 根来 誠司 兵庫県立大学, 大学院・工学研究科, 教授 (90156159)
• 研究分担者: 武尾 正弘 兵庫県立大学, 大学院・工学研究科, 准教授 (40236443) ; 加藤 太一郎 兵庫県立大学, 大学院・工学研究科, 助教 (60423901) ; 樋口 芳樹 兵庫県立大学, 大学院・生命理学研究科, 教授 (90183574) ; 柴田 直樹 兵庫県立大学, 大学院・生命理学研究科, 准教授 (30295753) ; 中野 英彦 (甲野 英彦) 兵庫県立大学, 大学院・工学研究科, 教授 (20047608)
• 研究期間 (年度): 2006 – 2009
• 研究課題ステータス: 完了 (2009年度)
• 配分額: 18,180千円 (直接経費: 15,300千円、間接経費: 2,880千円); 2009年度: 2,860千円 (直接経費: 2,200千円、間接経費: 660千円); 2008年度: 2,860千円 (直接経費: 2,200千円、間接経費: 660千円); 2007年度: 6,760千円 (直接経費: 5,200千円、間接経費: 1,560千円); 2006年度: 5,700千円 (直接経費: 5,700千円)
• キーワード: ナイロンオリゴマー / X線結晶構造解析 / 酵素進化 / βラクタマーゼ / カルボン酸エステル分解酵素 / Arthrobacter / 6-アミノカプロン酸 / 6-Aminohexanoate oligomer / ナイロンオリゴマー分解酵素 / アミド合成 / 耐熱性酵素 / N-terminal nucleophile hydrolase / maloamidase / 6-Aminohexanoate-cyclic dimer / Agromyces / Kokuria / 6-aminohexanoate-oligomer hydrolase / Ntn amidohydrolase

研究概要

Arthrobacter sp.KI72株が保持するプラスミドpOAD2上には、高機能型ナイロンオリゴマー分解酵素(NylB)、およびNylB類似カルボン酸エステル分解酵素(NylB')がコードされており、非天然物質に対する微生物の適応・進化を分子レベルで解析する上で恰好の系である。本研究ではNylB/NylB'およびその基質複合体の立体構造を解析した。また、立体構造から触媒機能に重要と推定されるアミノ酸残基(Ser112, Lys115, Asp181, Tyr215, Asn266, Tyr370)を選定後、各種の変異酵素を取得した。機能変化との相関から、触媒機能に関わるアミノ酸残基を特定した。さらに、NylB/NylB'は、微水系で効率的にアミド合成反応を触媒するが、合成/分解活性の比が181位、187位のアミノ酸置換で大きく影響する現象を見いだした。変異酵素の立体構造解析から非天然アミドの高効率合成に必要な構造基盤を明らかにした。

研究成果

• [雑誌論文] Enzymatic synthesis of nylon-6 units in organic solvents containing low concentrations of water. (2010)
  • 著者名/発表者名: Kawashima, Y., Yasuhira, K., Shibata, N., Matsuura, Y., Tanaka, Y., Taniguchi, M., Miyoshi, Y., Takeo, M., Kato, D., Higuchi, Y., Negoro, S.
  • 雑誌名: J. Mol. Cat. B: Enzymatic 64 ページ: 81-88
  • 査読あり
• [雑誌論文] X-ray crystallographic analysis of the 6-aminohexanoate cyclic dimer hydrolase: catalytic mechanism and evolution of an enzyme responsible for nylon-6 byproduct degradation. (2010)
  • 著者名/発表者名: Yasuhira, K. Shibata, N., Mongami, G., Uedo, Y., Atsumi, Y., Kawashima, Y., Hibino, A, Tanaka, Y., Lee, Y-Ho, Kato, D., Takeo, M., Higuchi, Y., Negoro, S.
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 285 ページ: 1239-1248
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structural basis of the evolution of nylon-oligomer hydrolase NylB. (2010)
  • 著者名/発表者名: Higuchi, Y., Shibata, N., Kawashima, Y., Ohki, T, Negoro, S.
  • 雑誌名: Viva Origino. (in press)
  • NAID: 110007651043
  • 査読あり
• [雑誌論文] Enzymatic synthesis of nylon-6 units in organic solvents containing low concentrations of water (2010)
  • 著者名/発表者名: Kawashima, Y., Yasuhira, K., Shibata, N., Matsuura Y., Tanaka, Y Taniguchi, M, Miyoshi, Y, Takeo, M Kato, D, Higuchi, Y, Negoro, S.
  • 雑誌名: Journal of Molecular Catalysis B : Enzymatic 64 ページ: 81-88
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structural basis of the evolution of nylon-oligomer hydrolase, Ny1B (2010)
  • 著者名/発表者名: Higuchi, Y, Shibata, N, Kawashima, Y, Ohki, T, Negoro, S.
  • 雑誌名: Viva Origino (印刷中)
  • 査読あり
• [雑誌論文] X-ray crystallographic analysis of the 6-aminohexanoate cyclic dimer hydrolase : catalytic mechanism and evolution of an enzyme responsible for nylon-6 byproduct degradation (2010)
  • 著者名/発表者名: Yasuhira, K, Shibata, N, Mongami, G Uedo, Y, Atsumi, Y, Kawashima, Y, Hibino, A, Tanaka, Y, Lee, Y-Ho, Kato, D, Takeo, M, Higuchi, Y, Negoro, S
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 285 ページ: 1239-1248
  • 査読あり
• [雑誌論文] Molecular design of a nylon-6 byproduct-degrading enzyme from a carboxylesterase with a βlactamase fold. (2009)
  • 著者名/発表者名: Kawashima Y. Ohki T. Shibata N. Higuchi Y, Takeo M, Kato D, Negoro S.
  • 雑誌名: FEBS J. 276 ページ: 2547-2556
  • 査読あり
• [雑誌論文] Two alternative modes for optimizing nylon-6 byproduct hydrolytic activity from a carboxylesterase with a β-lactamase fold. (2009)
  • 著者名/発表者名: Ohki T, Shibata N, Higuchi Y, Kawashima Y, Takeo M, Kato D, Negoro S
  • 雑誌名: Protein Science 18 ページ: 1662-1673
  • 査読あり
• [雑誌論文] Two alternative modes for optimizing nylon-6 byproduct hydrolytic activity from a carboxylesterase with b-lactamase fold : x-ray crystallo-graphic analysis of directly evolved 6-aminohexanoate-dimer hydrolase (2009)
  • 著者名/発表者名: Ohki, T, Shibata, N, Higuchi, Y.Kawashima, Y, Takeo, M, Kato, D.Negoro, S.
  • 雑誌名: Protein Science 18 ページ: 1662-1673
  • 査読あり
• [雑誌論文] Molecular design of a nylon-6 byproduct-degrading enzyme from a carboxylesterase with a β-lactamase fold (2009)
  • 著者名/発表者名: Kawashima, Y.Ohki, T.Shibata, N Higuchi, Y.Wakitani, Y.Matsuura, Y.Nakata, Y, Takeo, M, Kato, D, Negoro, S.
  • 雑誌名: FEBS Journal 276 ページ: 2547-2556
  • 査読あり
• [雑誌論文] Molecular design of a nylon-6 byproduct-degrading enzyme from a carboxylesterase with a βlactamase fold (2009)
  • 著者名/発表者名: Kawashima Y. Ohki T. Shibata N. Higuchi Y, Takeo M, Kato D, Negoro S.
  • 雑誌名: FEBS J. 276 ページ: 2547-2556
• [雑誌論文] Two alternative modes for optimizing nylon-6 byproduct hydrolytic activity from a carboxylesterase with a β-lactamase fold (2009)
  • 著者名/発表者名: Ohki T, Shibata N, Higuchi Y, Kawashima Y, Takeo M, Kato D, Negoro S
  • 雑誌名: Protein Science (in press)
• [雑誌論文] Molecular design of a nylon-6 byproduct-degrading enzyme from acarboxylesterase with a β-lactamase fold. (2009)
  • 著者名/発表者名: Kawashima, Y. Shibata, N., Takeo, M., Kato, D. Negoro, S.
  • 雑誌名: FEBS Journal 276 ページ: 2547-2556
  • 査読あり
• [雑誌論文] Mechanism of 4-nitrophenol oxidation in Rhodococcus sp. Strain PN1 : characterization of the two-component 4-nitrophenol hydroxylase and regulation of its expression (2008)
  • 著者名/発表者名: Takeo, M., Murakami, M., Niihara, S., Yamamoto, K. Kato, D., Negoro, S.
  • 雑誌名: Journal of Bacteriology 190 ページ: 7367-7374
  • 査読あり
• [雑誌論文] Nylon-oligomer degrading enzyme/substrate complex. (2007)
  • 著者名/発表者名: Negoro S, Shibata N, Kato D, Takeo M, Higuchi Y
  • 雑誌名: J. Mol. Biol. 370 ページ: 142-156
  • 査読あり
• [雑誌論文] 6-Amino-hexanoate oligomer hydrolases from the alkalophilic bacteria Agromyces sp. strain KY5R and Kocuria sp. strain KY2. (2007)
  • 著者名/発表者名: Yasuhira K, Tanaka Y, Shibata H, Kato D, Takeo M, Negoro S
  • 雑誌名: Appl. Environ. Microbiol. 73 ページ: 7099-7102
  • 査読あり
• [雑誌論文] Genetic organization of nylon-oligomer-degrading enzymes from an alkalophilic bacterium Agromyces sp. KY5R. (2007)
  • 著者名/発表者名: Yasuhira K, Uedo Y, Takeo M, Kato D, Negoro S
  • 雑誌名: J. Biosci. Bioeng. 104 ページ: 521-524
  • NAID: 110006533091
• [雑誌論文] Nylon-oligomer degrading enzyme/substrate complex (2007)
  • 著者名/発表者名: Negoro S, Shibata N, Kato D, Takeo M, Higuchi Y
  • 雑誌名: J. Mol. Biol. 370 ページ: 142-156
• [雑誌論文] 6-Amino- hexanoate oligomer hydrolases from the alkalophilic bacteria Agromyces sp. strain KY5R and Kocuria sp. strain KY2 (2007)
  • 著者名/発表者名: Yasuhira K, Tanaka Y, Shibata H, Kato D, Takeo M, Negoro S
  • 雑誌名: Appl. Environ. Microbiol. 73 ページ: 7099-7102
• [雑誌論文] Genetic organization of nylon-oligomer-degrading enzymes from an alkalophilic bacterium Agromyces sp. KY5R (2007)
  • 著者名/発表者名: Yasuhira K, Uedo Y, Takeo M, Kato D, Negoro S
  • 雑誌名: J. Biosci. Bioeng. 104 ページ: 521-524
  • NAID: 110006533091
• [雑誌論文] Nylon-oligomen degrading enzyme/substrate complex:catalytic mechanism of 6-aminohexanoate-dimer hydrolase (2007)
  • 著者名/発表者名: S.Negoro, T.Ohki, N.Shibata, H.Hayashi, H.Nakano, K.Yasuhira, D.Kato, M.Takeo & Y.Higuchi
  • 雑誌名: Journal of Molecular Biology 370 ページ: 142-156
  • 査読あり
• [雑誌論文] 6-Aminohexanoate-oligomer hydrolase from the alkalophilic bacteria Agromyces sp. KY5R and Kocuria sp.KY2 (2007)
  • 著者名/発表者名: K.Yasuhira, Y.Tanaka, H.Shibata, D.Kato, M.Takeo, and S.Negoro.
  • 雑誌名: Applied and Environmental Microbiology 73 ページ: 7099-7102
  • 査読あり
• [雑誌論文] Purification and characterization of alkylcatechol 2,3-dioxygenase from butylphenol degradation pathway of Pseudomonas putida MT4. (2007)
  • 著者名/発表者名: T.Takeo, M.Nishimura, H.Takahashi, C.Kitamura, D.Kato, and S.Negoro.
  • 雑誌名: J.Biosci.Bioeng. 104 ページ: 309-314
  • NAID: 110006437013
  • 査読あり
• [雑誌論文] Enzyme-linked immunosorbent assay of nonylphenol using antibody-bound microfluid filters in certical fluidic operation. (2007)
  • 著者名/発表者名: K.Matsui, I.Kawaji, Y.Utsumi, Y.Ukita, M.Takeo, D.Kato, and S.Negoro.
  • 雑誌名: J.Biosci.Bioeng. 104 ページ: 347-350
  • 査読あり
• [雑誌論文] 多機能フィルタを用いた垂直流体操作の挙動予測と検証 (2007)
  • 著者名/発表者名: 藤原 邦代、浮田 芳昭、浅野 豪文、松井 勝弘、武尾 正弘、根来 誠司、内海 裕一
  • 雑誌名: 電気学会論文誌(C) 127 ページ: 210-216
  • NAID: 10017641280
  • 査読あり
• [雑誌論文] 積層型マイクロリアクターを用いた酵素免疫測定法による生体物質測定系の開発 (2007)
  • 著者名/発表者名: 松井 勝弘、森本 祥平、浅野 豪文、加藤 太一郎、武尾 正弘、内海 裕一、根来 誠司
  • 雑誌名: 電気学会論文誌(C) 127 ページ: 204-209
  • NAID: 10018480527
  • 査読あり
• [雑誌論文] New application of firefly luciferase:it can catalyze the enantioselective thioester formation of 2-arylpropanoic acid (2007)
  • 著者名/発表者名: D.Kato, K.,Teruya H. Yoshida M.Takeo, S.Negoro, and H.Ohta.
  • 雑誌名: FEBS Journal 274 ページ: 3877-3885
  • 査読あり
• [雑誌論文] Purification and characterization of catechol 2,3-dioxygenase from the aniline degradation pathwary from Acinetobacter sp.YAA and its mutant enzyme,which resist substrate inhibition. (2007)
  • 著者名/発表者名: T.Takeo, M.Nishimura, M.Shirai, H.Takahashi, and S.Negoro.
  • 雑誌名: Bioscience Biotechnology Biochemistry 71 ページ: 1668-1675
  • 査読あり
• [雑誌論文] Immunoassay usingmicrfluid filters constructed by deep X-ray lithography. (2007)
  • 著者名/発表者名: K.Matsui, Y.Ustumi, Y.Ukita, M.Takeo, D.Kato, and S.Negoro
  • 雑誌名: Bioscience Biotechnology Biochemistry 71 ページ: 3098-3101
  • 査読あり
• [雑誌論文] Mutational analysis of 6-amino-hexanoate-dimer hydrolase. (2006)
  • 著者名/発表者名: Ohki T, Wakitani Y, Takeo M, Yasuhira K, Shibata N, Higuchi Y, Negoro S
  • 雑誌名: FEBS Lett 580 ページ: 5054-5058
  • 査読あり
• [雑誌論文] Crystallization and X-ray diffraction analysis of 6-aminohexanoate-cyclic dimer hydro-lase from Arthrobacter sp. KI72. (2006)
  • 著者名/発表者名: Yasuhira K, Shibata N, Negoro S, Takeo M, Higuchi Y.
  • 雑誌名: Acta Cryst. F62 ページ: 1209-1211
  • 査読あり
• [雑誌論文] Mutational analysis of 6-amino- hexanoate-dimer hydrolase (2006)
  • 著者名/発表者名: Ohki T, Wakitani Y, Takeo M, Yasuhira K, Shibata N, Higuchi Y, Negoro S
  • 雑誌名: FEBS Lett 580 ページ: 5054-5058
• [雑誌論文] Crystallization and X-ray diffraction analysis of 6-aminohexanoate-cyclic dimer hydro- lase from Arthrobacter sp. KI72 (2006)
  • 著者名/発表者名: Yasuhira K, Shibata N, Negoro S, Takeo M, Higuchi Y.
  • 雑誌名: Acta Cryst. F62 ページ: 1209-1211
• [雑誌論文] Mutational analysis of 6-aminohexanoate-dimer hydrolase : relationship between nylon oligomer hydrolytic and esterolytic activities (2006)
  • 著者名/発表者名: T.Ohki, Y.Wakitani, M.Takeo, K.Yasuhira, N.Shibata, Y.Higuchi, S.Negoro.
  • 雑誌名: FEBS Letters 580 ページ: 5054-5058
• [雑誌論文] Characterization of the alkylphenol degradation gene cluster in Pseudomonas putida MT4 and evidence of oxidation of alkylphebnols and alkylcatechols with a medium-length alkyl chain. (2006)
  • 著者名/発表者名: M.Takeo, S.K.Prabu, C.Kitamura, M.Hirai, H.Takahashi, D.Kato, S.Negoro
  • 雑誌名: J.Biochem.Bioeng. 102(4) ページ: 352-361
• [雑誌論文] アルカリ性ナイロンオリゴマー分解菌ノ分離 : 6-アミノカプロン酸オリゴマー加水分解酵素遺伝子のクローニングと配列分析 (2006)
  • 著者名/発表者名: 安平健吾, 武尾正弘, 根来誠司
  • 雑誌名: 日本水処理生物学会誌 42(4) ページ: 199-205
• [雑誌論文] 積層型マイクロ流体デバイスの製作と内分泌攪乱物質分析への応用 (2006)
  • 著者名/発表者名: 松井勝弘, 大村貴士, 森本祥平, 浅野豪文, 浮田芳昭, 内海裕一, 武尾正弘, 根来誠司
  • 雑誌名: 水処理技術 47 ページ: 151-156
• [雑誌論文] Crystallization and X-ray diffraction analysis of 6-aminohezanoate-cyclic dimer hydrolase from Arthrobacter sp.K172 (2006)
  • 著者名/発表者名: K.Yasuhira, Y.Uedo, N.Shibata, S.Negoro, M.Takeo, Y.Higuchi.
  • 雑誌名: Acta Crystallographica F62 ページ: 1209-1211
• [学会発表] エコ・ナノ・バイオ境界領域の開拓を目指して (2009)
  • 著者名/発表者名: 根来誠司
  • 学会等名: 日本材料学会 UFA研究分科会 第10回講演会
  • 発表場所: 大阪大学
  • 年月日: 2009-12-08
• [学会発表] 加水分解酵素の逆反応によるアミド合成:高効率触媒の形成要件 (2009)
  • 著者名/発表者名: 河島康之, 松浦悠介, 柴田直樹, 田中優佑, 小林達也, 武尾正弘, 加藤太一郎, 樋口芳樹, 根来誠司
  • 学会等名: 日本生物工学会 第61回大会
  • 発表場所: 名古屋大学
  • 年月日: 2009-09-24
• [学会発表] N-terminal nucleophile(Ntn)hydrolase superfamily(Ny1C)の耐熱化機構 (2009)
  • 著者名/発表者名: 柴田浩, 田中優佑, 橋本悠, 松浦悠介, 柴田直樹, 李映昊, 櫻井一正, 加藤太一郎, 武尾正弘, 樋口芳樹, 後藤祐児, 根来誠司
  • 学会等名: 日本生物工学会 第61回大会
  • 発表場所: 名古屋大学
  • 年月日: 2009-09-24
• [学会発表] 6-アミノヘキサン酸環状2量体加水分解酵素(Ny1A)の触媒機構 (2009)
  • 著者名/発表者名: 安平健吾, 柴田直樹, 門上剛, 厚海悠, 日比野敦, 吉野拓真, 河島康之, 加藤太一郎, 武尾正弘, 樋口芳樹, 根来誠司
  • 学会等名: 日本生物工学会 第61回大会
  • 発表場所: 名古屋大学
  • 年月日: 2009-09-24
• [学会発表] ナイロンオリゴマー分解酵素(Ny1C)の安定性と触媒機能に及ぼすアミノ酸置換効果 (2009)
  • 著者名/発表者名: 柴田浩, 熊谷尚也, 松浦悠介, 田中優佑, 橋本悠, 加藤太一郎, 柴田直樹, 武尾正弘, 樋口芳樹, 根来誠司
  • 学会等名: 日本生物工学会 第61回大会
  • 発表場所: 名古屋大学
  • 年月日: 2009-09-24
• [学会発表] ナイロンオリゴマー分解酵素の実験室内進化 : 触媒中心形成の構造基盤 (2008)
  • 著者名/発表者名: 大木卓, 柴田直樹, 武尾正弘, 加藤太一郎, 樋口芳樹, 根来誠司
  • 学会等名: 第60回日本生物工学会大会
  • 発表場所: 東北学院大学
• [学会発表] ナイロンオリゴマー分解酵素によるアミド合成・分解機能とアミノ酸置換効果 (2008)
  • 著者名/発表者名: 河島康之, 松浦悠介, 柴田直樹, 武尾正弘, 加藤太一郎, 樋口芳樹, 根来誠司
  • 学会等名: 第60回日本生物工学会大会
  • 発表場所: 東北学院大学
• [学会発表] Rhodococcus sp. PN1 株の4-ニトロフェノール分解における二つの酸化酵素系の役割 (2008)
  • 著者名/発表者名: 山本健太, 貞弘建, 加藤太一郎, 武尾正弘, 根来誠司
  • 学会等名: 第60回日本生物工学会大会
  • 発表場所: 東北学院大学
• [学会発表] ホタルルシフェラーゼの発光活性と2-アリールプロパン酸に対する立体選択的なチオェステル化活性の関係 (2008)
  • 著者名/発表者名: 加藤太一郎, 横山敬佑, 吉田裕充, 番匠亜沙美, 武尾正弘, 根来誠司
  • 学会等名: 第60回日本生物工学会大会
  • 発表場所: 東北学院大学
• [学会発表] 非常に簡単なアミノアシル-tRNAの作り方 (2008)
  • 著者名/発表者名: 加藤太一郎, 大迫淳一, 松本剛, 武尾正弘, 根来誠司
  • 学会等名: 第12回生体触媒化学シンポジウム
  • 発表場所: 東邦大学
• [学会発表] 6-アミノカプロン酸環状2量体加水分解酵素・基質複合体のX線結晶構造解析 (2007)
  • 著者名/発表者名: 安平 健吾、柴田 直樹、門上 剛、樋口 芳樹、加藤 太一郎、武尾 正弘、根来 誠司
  • 学会等名: 日本生物工学会
  • 発表場所: 広島大学
  • 年月日: 2007-09-25
• [学会発表] エンド型6-アミノカプロン酸オリゴマー加水分解酵素(E3)のX線結晶構造解析 (2007)
  • 著者名/発表者名: 安平 健吾, 柴田 直樹, 柴田 浩, 田中 康仁, 樋口 芳樹, 加藤 太一郎, 武尾 正弘, 根来 誠司
  • 学会等名: 日本生物工学会
  • 発表場所: 広島大学
  • 年月日: 2007-09-25
• [備考] ホームページ
  • URL: http://www.eng.u-hyogo.ac.jp/msc/msc3/
• [備考]
  • URL: http://www.eng.u-hyogo.ac.jp/msc/msc3/top.html
• [産業財産権] 遊離カルボン酸・アミンの直接縮合反応を触媒する酵素の設計方法及びナイロンオリゴマーの酵素的製造方法 (2006)
  • 発明者名: 根来誠司、武尾正弘、加藤太一郎、樋口芳樹、柴田直樹
  • 産業財産権番号: 2006-239119
  • 出願年月日: 2006-09-04
  • 取得年月日: 2006-09-04
• [産業財産権] 遊離カルボン酸・アミンの直接縮合反応を触媒する酵素の設計方法及びナイロンオリゴマーの酵素的製造方法 (2006)
  • 発明者名: 根来誠司, 武尾正弘, 加藤太一郎, 樋口芳樹, 柴田直樹
  • 権利者名: 兵庫県
  • 産業財産権番号: 2006-239119
  • 出願年月日: 2006-09-04
• [産業財産権] 遊離カルボン酸・アミンの直接縮合反 応を触媒する酵素の設計方法及びナイロンオリゴマーの酵素的製造方法
  • 発明者名: 根来誠司, 武尾正弘, 加藤太一郎, 樋口芳樹, 柴田直樹
  • 産業財産権番号: 2006-239119