| 研究課題/領域番号 |
18380057
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用微生物学
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
片岡 道彦 京都大学, 農学研究科, 准教授 (90252494)
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| 研究分担者 |
清水 昌 京都大学, 農学研究科, 教授 (70093250)
小川 順 京都大学, 農学研究科, 助教 (70281102)
櫻谷 英治 京都大学, 農学研究科, 助教 (10362427)
萩下 大郎 京都大学, 農学研究科, 准教授 (20432346)
日比 慎 京都大学, 農学研究科, 助教 (30432347)
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| 研究期間 (年度) |
2006 – 2007
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| 研究課題ステータス |
完了 (2007年度)
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| 配分額 *注記 |
16,410千円 (直接経費: 14,700千円、間接経費: 1,710千円)
2007年度: 7,410千円 (直接経費: 5,700千円、間接経費: 1,710千円)
2006年度: 9,000千円 (直接経費: 9,000千円)
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| キーワード | キラル化合物 / カルボニル還元酵素 / バイオ不斉還元 / アミノアルコート脱水素酵素 / ランダム変異 / Agrobacterium / Rhodococcus / アミノアルコール脱水素酵素 / Hansenula |
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| 研究概要 |
本研究ではいくつかの窒素含有キラル化合物の生産に有用なカルボニル還元酵素のタンパク質科学・遺伝子工学の面からの解析を行い、これをバイオ不斉還元システムに応用した効率的な生産プロセスの開発を成し遂げようとしたものである。
(1)3-キヌクリジノン還元酵素活性を有するAgrobacterium tumefacienから、不斉還元反応を触媒する酵素の単離を行い、諸性質の解明とアミノ酸配列の解析を行った。その結果、SDRスーパーファミリーに属するタンパク質と判明した。さらに、アミノ酸配列情報をもとに遺伝子のクローニングを行い、大腸菌内で大量発現させることに成功した。還元反応に必要な補酵素NADHを供給する系としてグルコース脱水素酵素遺伝子を、同じ大腸菌内に共発現させた。この共発現菌体を触媒として、3-キヌクリジノンの不斉還元反応を行ったところ、20%基質を定量的に変換して(R)-3-キヌクリジノールを生産することに成功した
(2)Rhodococcus erythropolisのアミノアルコール脱水素酵素遺伝子の大量発現大腸菌を触媒として、MAK還元反応の検討を行った。効率的生産プロセス開発の障害となる生成物阻害を解除するため、本酵素遺伝子のランダム変異を行い安定性の優れた変異型酵素を取得した。これらの変異酵素を解析した結果、5カ所アミノ酸残基に置換変位が導入されていることが判明した。また、本酵素はアミノアルコール類により強く誘導されるが、その発現調節機構も明らかにした。
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