| 研究課題/領域番号 |
18500304
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
神経化学・神経薬理学
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| 研究機関 | 独立行政法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
福永 優子 独立行政法人理化学研究所, 生体マルチソーム研究チーム, 研究員 (80254522)
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| 研究分担者 |
宮澤 淳夫 独立行政法人理化学研究所, 生体マルチソーム研究チーム, チームリーダー (60247252)
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| 研究期間 (年度) |
2006 – 2007
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| 研究課題ステータス |
完了 (2007年度)
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| 配分額 *注記 |
4,110千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 510千円)
2007年度: 2,210千円 (直接経費: 1,700千円、間接経費: 510千円)
2006年度: 1,900千円 (直接経費: 1,900千円)
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| キーワード | MAGUKs / Ca^<2+> / CaM / FRET / 分子内相互作用 / 分子間相互作用 / 共焦点レーザースキャン顕微鏡 / CFP / YFP / 共焦点レーザースキヤン顕微鏡 / PDZドメイン / SH3-GKドメイン |
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| 研究概要 |
細胞膜裏打ちタンパク質であるMAGUKファミリーに属するタンパク質(MAGUKs)は、三つのPDZドメインとSH3-GKドメインから構成される。我々の以前の研究より、MAGUKsへのSH3-GKドメインリガンドの結合により、SH3-GKドメインの分子内相互作用に変化がおこり、分子間相互作用ができるようになることが推測された。これを証明するために、当該研究において、MAGUKsとCa^2+/CaMの相互作用と、MAGUKsの分子内相互作用から分子間相互作用への変換が、生理的条件下で起こること、およびその生理的意義を検討したいと考えた。そこで、細胞内で起こる分子間相互作用をモニターすることができるFRET(蛍光共鳴エネルギー移動)実験系の確立を進めた。まず、FRETをモニターするためCFP-CaM-M13-YFPコンストラクトを作成したところ、蛍光分光光度計を用いた測定によりCa^2+存在下でFRETを確認できた(Ca^2+有無によるアクセプター/ドナー比の変化率は約60%)。そこで、このCFP-CaM-M13-YFPを用いて、細胞内Ca^2+濃度の上昇時にFRETを捉えることができる顕微鏡システムを確立した。次に、MAGUKs(PSD-95とSAP102)とCa^2+/CaM間のFRETの検討を行った。1分子FRETである、mVenus-PSD-95(結合に関わるドメイン)-CaM-CFPコンストラクトとmVenus-SAP102(結合に関わるドメイン)-CaM-CFPコンストラクトを作成した。蛍光分光光度計で測定したところ、Ca^2+の有無によるアクセプター/ドナー比の変化率は20-30%であった。PSD-95とSAP102がCa^2+/CaMと相互作用することを、FRETによって確認することができた。
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