| 研究概要 |
マウスES細胞胚様体(EB)の遺伝子発現を定量的に解析するためにReal-Time PCRを行い、そのデータをもとにEBの規格化を行った。
1,種々の規格のEBを作成
EB形成容器、播種細胞数、EB形成の期間、酸素条件、栄養条件等を変化させて、さまざまな規格のEBを形成させた。すなわち、最も一般的なハンギング・ドロップ法によって作成したEB、MPCコーティング96-well丸底プレート及び肝細胞スフェロイド形成用96-well丸底プレート(セルタイトスフェロイドプレート)によりEBを作成した。MPCコーティング96-well丸底プレートにおいては、EB形成に用いる初期細胞数も変化させた。
2,EBの遺伝子解析(Real-Time PCR法による解析)
1,で作成したEBにおいて発現する分化マーカー遺伝子(Oct3/4, Rex1, GATA4, GATA6, TTR, AFP, α-MHC, Nkx2.5等)をReal-Time PCR法で定量的に解析した。
3,各種EBにおける遺伝子発現パターンの図式化
EBにおける遺伝子発現の特徴が一目で分かるように、遺伝子発現パターンを図式で表した。
4,遺伝子発現パターンとEBの分化傾向の関連性を確認
EBの持つ遺伝子発現パターンとEBの分化傾向に関連があるかどうかを確認した。その結果、α-MHCとNkx2.5の遺伝子発現の高いEBからは拍動する心筋細胞の分化効率が顕著に高かった。また、TTRとAFPを高く発現しているEBからは、卵黄嚢様の細胞が発生しやすい傾向が見られた。このことは、遺伝子発現パターンがEBの分化傾向を端的に反映していることを示している。
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