研究課題
基盤研究(C)
本研究では、植物ゲノム中に多数存在する三種類の酸素添加酵素ファミリー(P450/FMO/20GD)について、組換え酵素を網羅的に作成して酵素ライブラリーを構築し、その一部について、植物体内での本来の機能を同定した。(1)データベースの構築:シロイヌナズナゲノムのP450/FMO/20GD遺伝子配列および推定アミノ酸配列を抽出し、進化系統樹解析を行なった。また、各種データベースから各遺伝子の器官別および各種処理別(光、ホルモン、ストレス、病害など)の転写量データを抽出しまとめた。(2)全長ORFの取得と組換え酵素の発現:P450/FMO/20GD(246/36/120遺伝子)の全長cDNAの多くは理研BRCより取得し、また、上記データベースを元にRT-PCRにより各器官RNAから単離した。以上のようなアプローチで、全オキシゲナーゼ遺伝子の約70%程度(120/26/85)のORF取得した。さらに、FMOおよび20GDのORFをpETベクターに挿入し、大腸菌で可溶性となるよう発現条件を最適化し、N末にHistidine-tagを融合した組換え酵素を発現させアフィニティー精製した。(3)植物P450とP450還元酵素の大腸菌を用いた共発現系の構築:P450の活性発現にはP450還元酵素によるNADPHからの電子伝達が必要であるが、大腸菌には還元酵素がない。P450をpCWoriに、還元酵素をpACYCにそれぞれ挿入し、2種のベクターを同時に大腸菌に導入することにより共発現させた結果、in vitroでP450酵素活性を検出することができた。このように、大腸菌を用いた植物P450の簡便な発現アッセイ系の構築に成功した。(4)At3g13610の解析:シロイヌナズナ根にはクマリン類であるスコポレチンの配糖体が多量に蓄積している。根で特異的に発現する20GDとしてAt3g13610の機能解析を行なった結果、フェルラ酸CoAエステルを基質としてオルト位(6'位)を水酸化する活性を検出し、At3g13610はFeruloyl-CoA6'-hydroxylaseであると同定した。
すべて 2008 2007 2006
すべて 雑誌論文 (19件) (うち査読あり 6件) 学会発表 (2件)
The Plant Journal 55
ページ: 989-999
Plant J. 55
Plant J. (In press)
植物の生長調節 42
ページ: 260-268
蛋白質・核酸・酵素 52
ページ: 1454-1464
40015648125
Reg of Plant Growth Dev 42
ページ: 19-29
Tanpakushitsu Kakusan Koso 52
ページ: 1454-64
The Plant Cell 18
ページ: 1008-1022
Biosci Biotechnol Biochem 70
ページ: 1713-1739
10018529395
ページ: 2071-2080
Phytochemistry 67
ページ: 1895-1906
Biochem Soc Trans 34
ページ: 1202-1205
ページ: 3275-3288
Plant Cell 18
Biosci. Biotechnol. Biochem. 70
ページ: 1731-1739
Biochem Society Transact 34
