微細構造を反映した仮想骨の作製-超高圧電子顕微鏡を用いたナノレベル解析-

• 研究課題/領域番号: 18592234
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 矯正・小児系歯学
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 上岡 寛 岡山大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 准教授 (80253219)
• 研究分担者: 山本 照子 東北大学, 大学院・歯学研究科, 教授 (00127250)
• 研究期間 (年度): 2006 – 2007
• 研究課題ステータス: 完了 (2007年度)
• 配分額: 3,880千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 480千円); 2007年度: 2,080千円 (直接経費: 1,600千円、間接経費: 480千円); 2006年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
• キーワード: 骨細胞 / 超高圧電子顕微鏡 / トモグラフィー / 3次元構築 / 仮想骨 / シミュレーション / 骨

研究概要

背景と研究目的
これまで、申請者らのグループでは骨中の細胞間ネットワークを共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察してきた。しかしながら、蛍光色素を用いたこれらの観察の解像度は、約500ナノメートルであるのに対して、対象となる構造はそれ以下(骨細管の径は、50-410nm)である。そのため、補正が必要となり、正確な立体構築には至らなかった。そこで、超高圧顕微鏡を用いることにより、解像度の問題を解決し、微細な構造を反映した仮想骨が作成されると考える。
実験
骨細胞ネットワークのトモグラフィーによる観察:16日齢ニワトリ胚頭蓋骨を3%パラホルムアルデヒドで固定し、2%プロタゴール染色液を用いて48時間の鍍銀染色を行った。その後、パラフィンに埋包し、3μm厚の切片を作製した。断層画像を得るために、切片は、金コロイド溶液に浸した。電子断層画像のためのデータサンプリングには、360°傾斜可能なホルダーを備えた3MV超高圧電子顕微鏡(H-3000,Hitachi社製)を用いた。画像は、CCDカメラ(TVIPS社製)に記録された。また、トモグラフィーで得られた断層画像と比較するために、同じ標本を用いて、70nm厚の組織切片を作製し、100KV TEMにて観察した。3次元構築はIMODを用いて行った。
有限要素解析:上記にえられた電子断層画像を用いて、骨細管は画像を二値化した後、TRI3D/VOLを用い領域抽出し、骨小腔はマニュアルトレースを行い、三次元仮想骨有限要素モデルを作製し、応力解析に供した。
結果
超高圧電子顕微鏡を用いて、銀染色された3マイクロ厚の切片から、電子断層画像を撮影し、得られた断層画像をもとに再構築された仮想骨を用いて、骨小腔から骨細管へ移行する領域において、応力の集中が観察され、同部における局所の変形が骨全体へかかる変形に比べて大きいことが予想された。

研究成果

• [雑誌論文] Hormonal, pH, and Calcium regulation of connexin 43 mediated dye transfer in osteocytes in chick calvaria. (2008)
  • 著者名/発表者名: Ishihara Y, Kamioka H, Honjo T, Ueda H, Takano-Yamamoto T, Yamashiro T
  • 雑誌名: Journal of Bone and Mineral Reserch 23 ページ: 350-360
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
  • 査読あり
• [雑誌論文] Hormonal, pH, and Calcium regulation of connexin 43 mediated dye transfer in osteocytes in chick calvaria (2008)
  • 著者名/発表者名: Ishihara, Y., Kamioka, H., Honjo, T., Ueda, H., Takano-Yamamoto, T., Yamashiro, T
  • 雑誌名: Journal of Bone and Mineral Research 23 ページ: 350-360
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Primary cultures of chick osteocytes retain functional gap junctions between osteocytes, and between osteocytes and osteoblasts (2007)
  • 著者名/発表者名: Kamioka H, Ishihara Y, Ris H, Murshid SA, Sugawara Y, Takano-Yamamoto T, Lim S
  • 雑誌名: Microscopy and Microanalysis 13 ページ: 108-117
  • NAID: 120002311469
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
  • 査読あり
• [雑誌論文] Actin and microtubule cytoskeletons of the processes of 3D-cultured MC3T3-El cells and osteocytes (2007)
  • 著者名/発表者名: Murshid SA, Kamioka H, Ishihara Y, Ando R, Sugawara Y, Takano-Yamamoto T
  • 雑誌名: Journal of Bone and Mineral Metabolism 25 ページ: 151-158
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
  • 査読あり
• [雑誌論文] 骨細胞の機能と力学負荷による骨代謝調節 (2007)
  • 著者名/発表者名: 手塚建一、上岡 寛
  • 雑誌名: 医学のあゆみ 221 ページ: 76-80
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Primary cultures of chick osteocytes retain functional gap junctions between osteocytes, and between osteocytes and osteoblasts (2007)
  • 著者名/発表者名: Kamioka, H., Ishihara, Y., Ris, H., Murshid, SA., Sugawara, Y., Takano-Yamamoto, T., Lim, S
  • 雑誌名: Microscopy and Microanalysis 13 ページ: 108-117
  • NAID: 120002311469
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Actin and microtubule cytoskeletons of the processes of 3D-cultured MC3T3-E1 cells and osteocytes (2007)
  • 著者名/発表者名: Murshid, SA., Kamioka, H., Ishihara, Y., Ando, R., Sugawam, Y., Takano-Yamamoto, T
  • 雑誌名: Journal of Bone and Mineral Metabolism 25 ページ: 151-158
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Mechanical Stress and Bone-from osteocyte biology to bone remodeling simulation (2007)
  • 著者名/発表者名: Tezuka, K., Kamioka, H
  • 雑誌名: Igaku no Ayumi 221 ページ: 76-80
  • NAID: 40015321596
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Primary cultures of chick osteocytes retain functional gap junctions between osteocytes, and between osteocytes and osteoblasts (2007)
  • 著者名/発表者名: Kamioka H. Ishihara Y, Ris H, Murshid SA, Sugawara Y, Takano-Yamamoto T, Lim S
  • 雑誌名: Microscopy and Microanalysis 13 ページ: 108-117
  • NAID: 120002311469
  • 査読あり
• [雑誌論文] Actin and microtubule cytoskeletons of the processes of 3D-cultured MC3T3-E1 cells and osteocytes (2007)
  • 著者名/発表者名: Murshid SA, Kamioka H, Ishihara Y, Ando R, Sugawara Y, Takano-Yamamoto T
  • 雑誌名: Journal of Bone and Mineral Metabolism 25 ページ: 151-158
  • 査読あり
• [雑誌論文] 骨微細構造を反映した仮想骨の作成 (2006)
  • 著者名/発表者名: 上岡 寛、山本照子
  • 雑誌名: 文科省ナノテクノロジー総合支援プロジェクト実績報告書 ページ: 82-83
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] 骨微細構造を反映した仮想骨の作成 (2006)
  • 著者名/発表者名: 上岡 寛、手塚建一、山本照子
  • 雑誌名: 超高圧電子顕微鏡センター年報 ページ: 107-110
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] 骨細胞における機械的刺激への応答能について (2006)
  • 著者名/発表者名: 上岡 寛、菅原康代、Murshid A Sakhr、石原嘉人、本城正、山本照子
  • 雑誌名: 生体医工学雑誌 44 ページ: 484-489
  • NAID: 110006249802
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Virtural bone reflecting microstructure of real bone (2006)
  • 著者名/発表者名: Kamioka, H., Yamamoto, T
  • 雑誌名: Report for Nanotechnology Support of the MEXT, Japan ページ: 82-83
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Virtural bone reflecting microstructure of real bone (2006)
  • 著者名/発表者名: Kamioka, H., Tezuka, K., Yamamoto, T
  • 雑誌名: Annual report of Ultra-high voltage electron microscope center ページ: 107-110
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Mechanosensitivity of osteocytes (2006)
  • 著者名/発表者名: Kamioka, H., Sugawara, Y., Murshid, SA., Ishihara, Y., Honjo, T., Yamamoto, T
  • 雑誌名: Medical and Biological Engineering ページ: 484-489
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Fluid shear stress induces less calcium response in a single primary osteocyte than in a single osteoblast : implication of different focal adhesion formation. (2006)
  • 著者名/発表者名: Kamioka H, Sugawara Y, Murshid SA, Ishihara Y, Honjo T, Takano-Yamamoto T
  • 雑誌名: Journal of Bone and Mineral Research 21(7) ページ: 1012-1021
• [雑誌論文] Brain-derived neurotrophic factor-immunoreactive primary sensory neurons in the rat trigeminal ganglion and trigeminal sensory nuclei. (2006)
  • 著者名/発表者名: Ichikawa H, Yabuuchi T, Jin HW, Terayama R, Yamaai T, Deguchi T, Kamioka H, Takano-Yamamoto T, Sugimoto T
  • 雑誌名: Brain Research 1081(1) ページ: 113-118
• [雑誌論文] αVβ3 integrin ligands enhance volume-sensitive calcium influx in mechanically stretched osteocytes (2006)
  • 著者名/発表者名: Miyauchi A, Gotoh M, Kamioka H, Notoya K, Sekiya H, Takagi Y, Yoshimoto Y, Ishikawa H, Chihara K, Takano-Yamamoto T, Fujita T, Mikuni-Takagaki Y
  • 雑誌名: Journal of Bone and Mineral Metabolism 24(6) ページ: 498-504
• [雑誌論文] The alteration of a mechanical property of bone cells during the process of changing from osteoblasts to osteocytes.
  • 著者名/発表者名: Sugawara Y, Ando R, Kamioka H, Murshid SA, Hashimoto K, Kataoka N, Tsujioka K, Ishihara Y, Yamashiro T. Takano-Yamamoto T
  • 雑誌名: Bone (印刷中)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
  • 査読あり
• [雑誌論文] The alteration of a mechanical property of bone cells during the process of changing from osteoblasts to osteocytes
  • 著者名/発表者名: Sugawara, Y., Ando, R., Kamioka, H., Murshid, SA., Hashimoto, K., Kataoka, N., Tsujioka, K., Ishihara, Y., Yamashiro, T., Takano-Yamamoto, T
  • 雑誌名: Bone (in press)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Primary cultures of chick osteocytes retain functional gap junctions between osteocytes, and between osteocytes and osteoblasts
  • 著者名/発表者名: Kamioka H, Ishihara Y, Ris H, Murshid SA, Sugawara Y, Takano-Yamamoto T, Lim S
  • 雑誌名: Microscopy and Microanalysis (印刷中)
  • NAID: 120002311469
• [雑誌論文] Actin and microtubule cytoskeletons of the processes of 3D-cultured MC3T3-E1 cells and osteocytes
  • 著者名/発表者名: Murshid SA, Kamioka H, Ishihara Y, Ando R, Sugawara Y, Takano-Yamamoto T
  • 雑誌名: Journal of Bone and Mineral Metabolism (印刷中)
• [雑誌論文] 骨細胞における機械的刺激への応答能について
  • 著者名/発表者名: 上岡 寛, 菅原康代, Murshid A Sakhr, 石原嘉人, 本城正, 山本照子
  • 雑誌名: 生体医工学雑誌 解説特集 (印刷中)
  • NAID: 110006249802
• [学会発表] 超高電圧TEMトモグラフィーを用いた骨細胞周囲の高精細構造・応力解析 (2007)
  • 著者名/発表者名: 上岡 寛、Murshid SA, 手塚建一、山本照子
  • 学会等名: 第25回日本骨代謝学会 ミニシンポジウム
  • 発表場所: 大阪市
  • 年月日: 2007-07-21
• [学会発表] 骨の機械的刺激への応答能を医工学的に解析するためにー (2007)
  • 著者名/発表者名: 上岡 寛
  • 学会等名: 岐阜大学大学院医学系研究科主催 特別講演
  • 発表場所: 岐阜市
  • 年月日: 2007-04-26
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [学会発表] Analysis of the mechanosensitivity of bone (2007)
  • 著者名/発表者名: Kamioka, H
  • 学会等名: Special lecture at Dept. of tissure and organ development reorganization and advanced medical science, Gifu Univ
  • 発表場所: Gifu
  • 年月日: 2007-04-26
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [学会発表] 超高電圧TEMトモグラフィーを用いた骨細胞周囲の高詳細構造・応力解析 (2007)
  • 著者名/発表者名: 上岡 寛、Murshid SA, 手塚建一、山本照子
  • 学会等名: 第25回日本骨代謝学会ミニシンポジウム
  • 発表場所: 大阪市
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [学会発表] Osteocyte in bone revealed by electron tomography. (2007)
  • 著者名/発表者名: Kamioka H, Murshid SA, Ishihara Y, Ando R, Sugawara Y, Kajimura N, Hasegawa T, Takaoka A, Tanakano-Yamamoto T
  • 学会等名: 16th International congress of the IFAA
  • 発表場所: Sapporo
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [学会発表] 生骨組織中での細胞間コミュニケーションに影響する外的調節因子について (2007)
  • 著者名/発表者名: 石原嘉人, 上岡寛、山本照子、山城隆
  • 学会等名: 第25回日本骨代謝学会
  • 発表場所: 大阪市
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [学会発表] Mechanosensitivity of a single osteocyte: Difference in cell process and cell body (2007)
  • 著者名/発表者名: Aonuma Y, Adachi T, Tanaka M, Hojo M, Takano-Yamamoto T, Kamioka H
  • 学会等名: Third Asian Pacific conference on biomechanics
  • 発表場所: 東京
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [学会発表] Osteocyte in bone revealed by electron tomography (2007)
  • 著者名/発表者名: Kamioka, H., Murshid, SA., Ishihara, Y., Ando, R., Sugawara, Y., Kajimura, N., Hasegawa, T., Takaoka, A., Tanakano-Yamamoto, T
  • 学会等名: 16th International congress of the IFAA
  • 発表場所: Sapporo
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [学会発表] Mechanosensitivity of a single osteocyte : Difference in cell process and cell body (2007)
  • 著者名/発表者名: Aonuma, Y., Adachi, T., Tanaka, M., Hojo, M., Takano-Yamamoto, T., Kamioka, H
  • 学会等名: 3rd Asian Pacific conference on biomechanics
  • 発表場所: Tokyo
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [学会発表] Microstructure and microstrain analysis using ultra-high voltage electron microscope (2007)
  • 著者名/発表者名: Kamioka, H., Murshid, SA., Tezuka, K., Yamamoto, T
  • 学会等名: The 22nd Annual meeting of the Japanese society for bone and mineral research
  • 発表場所: Osaka
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [学会発表] Regulator of cell-cell communication among osteocytes in bone (2007)
  • 著者名/発表者名: Ishihara, Y., Kamioka, H., Yamamoto, T., Yamashiro, T
  • 学会等名: The 22nd Annual meeting of the Japanese society for bone and mineral research
  • 発表場所: Osaka
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [図書] Interface Oral Health Science 2007 Less response of osteocyte than osteoblasts to mechanical force: Implication of different focal adhesion formation. (2007)
  • 著者名/発表者名: Takano-Yamamoto T, Kamioka H, Sugawara Y
  • 出版者: SPRINGER Ed: Watanabe M, Okuno 0