新規DNA結合モチーフ"TTpocket"を有する機能タンパク質の探索

• 研究課題/領域番号: 18657057
• 研究種目: 萌芽研究
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 分子生物学
• 研究機関: (財)東京都医学研究機構
• 研究代表者: 正井 久雄 財団法人東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 参事研究員 (40229349)
• 研究分担者: 神田 大輔 九州大学, 生体防御医学研究所, 教授 (80186618)
• 研究期間 (年度): 2006 – 2007
• 研究課題ステータス: 完了 (2007年度)
• 配分額: 3,400千円 (直接経費: 3,400千円); 2007年度: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円); 2006年度: 2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
• キーワード: PriAタンパク / 複製フォーク / DNA3'末端 / DNA結合 / X線構造解析 / DNA結合タンパク質 / 高次構造 / ゲノム安定性 / DNA末端 / DNA複製 / チェックポイント制御 / PriAタンパク質

研究概要

大腸菌PriAタンパク質は、停止した複製フォークを認識して結合する。PriAはN端180アミノ酸の領域にDNA結合ドメインを有し、停止複製フォークの構造を認識する。このDNA結合ドメインのN端側105アミノ酸内にDNA鎖の3'末端(three-prime terminus)を特異的に認識するポケット構造(TT pocket)が存在することを明らかにした。その高次構造をX線結晶構造解析で明らかにし、塩基配列非依存的な核酸末端の認識の構造的基盤を解明した。さらに、構造から予想される、核酸認識に重要なアミノ酸残基の置換により、3'末端認識が喪失した。現在これらの構造情報に基づき、同様な構造を有すると期待される構造をdata baseから探索することにより、他生物種、とくに真核細胞(動物細胞および分裂酵母)におけるTT pocketタンパク質の探索を行っている。また結合アッセイを用いて、in vitroにおける3'末端特異的な結合を指標に、期待される結合能を有するタンパク質の生化学的同定も行った。得られたタンパク質のMASS解析から、これらはヌクレオチド代謝に関与する酵素、およびアミノアシルtRNA合成酵素のひとつであった。これらは、いずれもヌクレオチドあるいは核酸に結合する酵素であり、DNA末端に依存した結合を示すことが説明される。現在、さらに結合活性を有する因子の探索をすすめている。また、PriA欠損株の機能相補を指標としたアッセイ系によるスクリーニングも計画している。
また、PriA欠損株の機能相補を指標としたアッセイ系によるスクリーニングも計画している。

研究成果

• [雑誌論文] "Identification of stimulators and inhibitors of CDC7 kinase in vitro." (2008)
  • 著者名/発表者名: Kakusho, N., Taniyama, C.,and Masai, H.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 282(印刷中)
  • 査読あり
• [雑誌論文] "Spatio-temporal dynamics of multicellular cell cycle progression." (2008)
  • 著者名/発表者名: Sakaue-Sawano, A., Kurokawa, H., Morimura, T., Hanyu, A., Hama, H., Kashiwagi, S., Fukami, K., Imamura, T., Ogawa, M., Masai, H.,and Miyawaki, A.
  • 雑誌名: Cell 132 ページ: 487-498
  • 査読あり
• [雑誌論文] "Cdc7-dependent phosphorylation of Mer2 facilitates initiation of yeast meiotic recombination." (2008)
  • 著者名/発表者名: Sasanuma, H., Hirota, K., Fukuda, T., Kakusho, N., Kugou, N., Kawasaki, Y., Shibata, T., Masai, H.,and Ohta, K.
  • 雑誌名: Genes Dev. 22 ページ: 398-410
  • 査読あり
• [雑誌論文] "Cdc7 kinase is required for Claspin phosphorylation in DNA replication checkpoint." (2008)
  • 著者名/発表者名: Kim, J-M., Yamada, M., Kakusho, N., Kanoh, Y., Takemoto, N.,and Masai, H.
  • 雑誌名: Oncogene 27(印刷中)
  • 査読あり
• [雑誌論文] "Structural basis of the 3'-end recognition of a leading strand in stalled DNAreplication forks by PriA." (2007)
  • 著者名/発表者名: Sasaki, K., Ose, T., Okamoto, N., Maenaka, K., Tanaka, T., Masai, H., Saito, M., Shirai, T.,and Kohda, D.
  • 雑誌名: EMBO J. 26 ページ: 2584-2593
  • 査読あり
• [雑誌論文] "Human Tim/Timeless-interacting protein,Tipin,is required for efficient progression of S phase and DNA replication checkpoint." (2007)
  • 著者名/発表者名: Yoshizawa-Sugata, N. and Masai, H.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 282 ページ: 2729-2740
  • 査読あり
• [雑誌論文] "Escherichia coli PriA protein:Two modes of DNA binding and activation of ATP hydrolysis." (2007)
  • 著者名/発表者名: Tanaka, T., Mizukoshi, T., Sasaki, K., Kohda, D.,and Masai, H.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 282 ページ: 19917-19927
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structural basis of the 3'-end recognition of a leading strand in stalled DNA replication forks by PriA. (2007)
  • 著者名/発表者名: Sasaki, K.
  • 雑誌名: EMBO J. (印刷中)
• [雑誌論文] Escherichia coli PriA protein : Two modes of DNA binding and activation of ATP hydrolysis. (2007)
  • 著者名/発表者名: Tanaka, T.
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. (印刷中)
• [雑誌論文] Human Tim/Timeless-interacting protein, Tipin, is required for efficient progression of S phase and DNA replication checkpoint. (2007)
  • 著者名/発表者名: Yoshizawa-Sugata, N.
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 282 ページ: 2729-2740
• [雑誌論文] Phosphorylation of MCM4 by Cdc7 kinase facilitates its interaction with Cdc45 on the chromatin. (2006)
  • 著者名/発表者名: Masai, H.
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 281 ページ: 39249-32961
• [雑誌論文] Replication initiation from a novel origin identified in the Th2 cytokine cluster locus requires a distant conserved non-coding sequence. (*cocommunicating authors) (2006)
  • 著者名/発表者名: Hayashida, T.
  • 雑誌名: J. Immunol. 176 ページ: 5446-5454
• [雑誌論文] Rad3-Cds1 mediates coupling of initiation of meiotic recombination with DNA replication : Mei4-dependent transcription as a potential target of meiotic checkpoint. (2006)
  • 著者名/発表者名: Ogino, K.
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 281 ページ: 1338-1344
• [雑誌論文] Stabilization of a stalled replication fork by concerted actions of two helicases. (2006)
  • 著者名/発表者名: Tanaka, T.
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 281 ページ: 3484-3493
• [雑誌論文] Crystallization and preliminary crystallographic analysis of the N-terminal domain of PriA from Escherlchia coli. (2006)
  • 著者名/発表者名: Sasaki, K.
  • 雑誌名: Biochim. Biophys. Acta. 1764 ページ: 157-160
• [雑誌論文] Nuclear import of Epstein-Barr Virus Nuclear Antigen 1 mediated by NPI-1 (Importin α5) is up- and down-regulated by phosphorylation of the nuclear localization signal for which Lys379 and Arg380 are essential. (2006)
  • 著者名/発表者名: Kitamura, R.
  • 雑誌名: J. Virol. 80 ページ: 1979-1991
• [学会発表] "REGULATION OF ESTABLISHMENT AND STABLE MAINTENANCE OFREPLICATION FORKS BY CDC7 KINASE" (2007)
  • 著者名/発表者名: 正井 久雄
  • 学会等名: 第30回日本分子生物学会年会、第80回日本生化学会大会合同大会BMB2007シンポジウム
  • 発表場所: パシフィコ横浜
  • 年月日: 2007-12-15
• [図書] "Regulation of DNA replication factors by E2F in cancer and embryonic stem cells"in"Control of Cellular Physiology by E2F Transcription Factors" (2008)
  • 著者名/発表者名: Fujii-Yamamoto, H., Yamada, M., and Masai, H.
  • 総ページ数: 12
  • 出版者: Research Signpost
• [図書] 「染色体サイクル:複製・分配・組換え・修復・クロマチン制御のメカニズムとその異常による疾患」序文実験医学増刊号 (2007)
  • 著者名/発表者名: 正井 久雄
  • 総ページ数: 1
  • 出版者: 羊土社
• [図書] 概論"染色体サイクル制御の分子メカニズム"実験医学増刊号「染色体サイクル」 (2007)
  • 著者名/発表者名: 正井 久雄、渡邊 嘉典
  • 総ページ数: 8
  • 出版者: 羊土社
• [図書] "MCMタンパク質のDNA複製における役割"実験医学増刊号「染色体サイクル」 (2007)
  • 著者名/発表者名: You Zhiying、正井 久雄
  • 総ページ数: 5
  • 出版者: 羊土社
• [図書] "Cdc7キナーゼによる複製フォーク制御"実験医学増刊号「染色体サイクル」 (2007)
  • 著者名/発表者名: 正井 久雄、松本 清治
  • 総ページ数: 8
  • 出版者: 羊土社
• [図書] 生化学辞典(分担)第4版 (2007)
  • 著者名/発表者名: 正井 久雄
  • 出版者: 東京化学同人
• [図書] "Southwestem法"「分子間相互作用解析ハンドブック」 (2007)
  • 著者名/発表者名: 田中 卓、正井 久雄
  • 総ページ数: 4
  • 出版者: 羊土社
• [図書] "UVクロスリンキング法"「分子間相互作用解析ハンドブック」 (2007)
  • 著者名/発表者名: You Zhiying、正井 久雄
  • 総ページ数: 4
  • 出版者: 羊土社
• [図書] 染色体サイクル : 複製・分配・組換え・修復・クロマチン制御のメカニズムとその異常による疾患序文 実験医学増刊号 染色体サイクル (2007)
  • 著者名/発表者名: 正井久雄
  • 総ページ数: 219
  • 出版者: 羊土社
• [図書] 染色体サイクル(概論"染色体サイクル制御の分子メカニズム" 実験医学 増刊号) (2007)
  • 著者名/発表者名: 正井久雄, 渡邊嘉典
  • 総ページ数: 219
  • 出版者: 羊土社
• [図書] 染色体サイクル("MCMタンパク質のDNAZ複製における役割"実験医学 増刊号) (2007)
  • 著者名/発表者名: Zhiying You, 正井久雄
  • 総ページ数: 219
  • 出版者: 羊土社
• [図書] 染色体サイクル(Cdc7キナーゼによる複製フォーク制御"実験医学増刊号) (2007)
  • 著者名/発表者名: 正井久雄, 松本清治
  • 総ページ数: 219
  • 出版者: 羊土社
• [図書] ヒトの分子生物学(村松正實 監訳) (2006)
  • 著者名/発表者名: 正井久雄(翻訳分担)
  • 総ページ数: 715
  • 出版者: 丸善株式会社
• [図書] 体細胞分裂に重要な役割を果たす分裂酵母Cdc7類似キナーゼ, Hsk1タンパク質は減数分裂期組換えの開始に必要とされる" 細胞工学 (2006)
  • 著者名/発表者名: 荻野桂子, 廣田耕志, 太田邦史, 正井久雄
  • 出版者: 秀潤社
• [備考]
  • URL: http://www.rinshoken.or.jp/CB/index-jp.htm