| 研究課題/領域番号 |
18750144
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
生体関連化学
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
大窪 章寛 東京工業大学, 大学院・生命理工学研究科, 助教 (60376960)
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| 研究期間 (年度) |
2006 – 2007
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| 研究課題ステータス |
完了 (2007年度)
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| 配分額 *注記 |
3,700千円 (直接経費: 3,700千円)
2007年度: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円)
2006年度: 2,400千円 (直接経費: 2,400千円)
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| キーワード | ゲノム / 核酸 / 有機化学 / 高分子化学 |
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| 研究概要 |
本研究は、10万塩基対以上の細菌のゲノムDNAを迅速かつ高純度で化学合成することを最終目的としている。汎用されているホスホロアミダイトDNA合成では、固相担体上に一塩基ずつ鎖伸長を行い、目的のオリゴヌクレオチドを得ている。しかし、数十量体のDNAオリゴマーであれば、迅速かつ高純度で安定供給が可能であるが、数百量体のDNAオリゴマーになると鎖伸長効率やデブリネーションの問題から化学合成が困難である。そこで、安定供給できる50-100量体の合成DNAオリゴマーを縮合ブロックとし、固相担体上でフラグメント合成を行うことで、10万塩基以上のDNA鎖の合成を目指して研究を進めてきた。
まず、10量体程度のオリゴヌクレオチドの末端をホスホロアミダイト化、もしくはH-ホスホネート化することで縮合ブロックを合成し、その後、別途合成したオリゴヌクレオチドと様々な条件下で縮合反応を検討した。しかし、予期に反してその縮合反応効率は非常に低く、この縮合反応の繰り返しにより、非常に長いDNAの合成は困難であることが分かった。そこで、この縮合反応を効率よく行うために、縮合ブッロクを一本鎖DNAリガーゼを用いて連結させる反応を考案した。この時、縮合ブッロクを順序よく連結させるためには、オリゴヌクレオチドの5'位水酸基にピロリン酸結合を介しアデノシンを導入する必要がある。このアデニル化されたオリゴヌクレオチドは、ホスホロアミダイトユニットを過剰のHOBtによって、活性化・リン酸転位反応を経て調整したリン酸化試薬を用いることで、世界で初めて、短時間に効率よく合成することに成功した。今後は、この縮合ブッロクを用いた酵素的連結反応を行い、長鎖DNAの合成を行っていく予定である。
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