| 研究概要 |
本年度の研究目的は,前年度に確立した手法を用いてウイルス感染,非感染細胞からそれぞれリン酸化タンパク質を分取,濃縮し,(1)LC/MSによる解析の最適化を図ると同時に,(2)二次元電気泳動によるタンパクの展開後,リン酸化タンパク質を染色したゲル画像を比較することにより,ウイルス感染細胞におけるタンパク質リン酸化パターン変動の定量的解析を行うことであり,以下のような成績を得た。
(1)ウイルス感染,非感染細胞由来のリン酸化タンパク質をトリプシン消化後,逆相カラムを用いた1次元LC/MS解析(以下1D)及び逆相カラムと陽イオン交換カラムを用いた2次元LC/MS解析(以下2D)を行った。その結果,検出される総タンパク質数は2Dでは1Dの約2.6倍(約1000個)であったが,1Dにおいて差異が観察された約80個のタンパクのうち,30%近くが2Dでは検出されなかった。それ故,2Dでもなおその分離能が充分でなく,さらなる分画ステップが必要であることが明らかとなった。
(2)本解析において採用している二次元電気泳動法の等電点泳動時のpH範囲は4-7であり,ある程度サンプルの3次元目の分画化が可能であることから,二次元電気泳動法による両サンプルの比較を行った。その結果,スポットの分離は良好であったが,有意な差のあるスポットはほとんど観察されなかった。そこで抗リン酸化アミノ酸抗体を用いたウエスタンブロット法により解析した結果,主要スポットを形成するようなタンパク質にもリン酸化されるアミノ酸に差異のあることが明らかとなり,タンパク質のリン酸化制御は単純なリン酸基の結合・解離のみでなく,リン酸化を受けるアミノ酸が変化することによる場合も多いことが示唆された。それ故,今後は抗リン酸化アミノ酸抗体を用いた免疫沈降法によりサンプルの分画・濃縮を行って解析する必要がある。
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