| 研究概要 |
TS/TK RNAi発現vectorの作製と遺伝子導入の確立
申請者は実験計画に基ずきTS,TKをそれぞれ抑制しえるRNA干渉分子をターゲットサイトで約10ずつ選択し,poly系miRNA発現ベクターに組み込んだ。
これらのRNA干渉分子を培養細胞に遺伝子導入し、約48時間後に細胞を回収、RNAを抽出し、TS,TK特異的real time PCRにてそれぞれの発現レベルを検討した。この内、特に(80-90%)それぞれのRNAレベルを低下させる干渉分子を選択した。
さらにそれぞれのRNA干渉分子を連結させる形にベクターに組み込みこれを同様にRNAレベルをreal time PCR法にて確認したところ、TS/TKをそれぞれ約80%低下させることが可能なダブルノックダウンRNA干渉分子を発現させることに成功した。このベクターは特異的にターゲットの遺伝子を抑制することをも確認した。さらに、GFP発現ベクターとこれらのダブルノックダウンRNA干渉分子を同時に培養細胞に遺伝子導入することでこれらのベクターの遺伝子導入効率が70%以上あることを確認した。
TS/TK抑制効果の確認のための、培養細胞における生化学的、形態学的解析
これらのRNA干渉分子を胆管癌細胞培養株へ導入しその生化学的、形態学的変化が起きるか否かを分子生物学的手法を用いて検討中である。光学顕微鏡においては明確な形態的変化は観察できなかった。また、細胞増殖能について次に検討する予定である。
|
