生体内凍結技法による移植腫瘍細胞組織の機能分子形態学的研究

• 研究課題/領域番号: 18890075
• 研究種目: 若手研究(スタートアップ)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 解剖学一般(含組織学・発生学)
• 研究機関: 山梨大学
• 研究代表者: 大野 伸彦 山梨大学, 大学院・医学工学総合研究部, 助教 (10432155)
• 研究期間 (年度): 2006 – 2007
• 研究課題ステータス: 完了 (2007年度)
• 配分額: 2,700千円 (直接経費: 2,700千円); 2007年度: 1,350千円 (直接経費: 1,350千円); 2006年度: 1,350千円 (直接経費: 1,350千円)
• キーワード: クライオバイオプシー法 / 生体内凍結技法 / 腫瘍細胞移植モデル / 血清蛋白免疫染色 / 構造的血管 / 機能的血管 / 虚血 / クライオピンセット / 浸漬固定法 / 細胞異形性 / 生体内脈管分布

研究概要

クライオバイオプシー法(Cb)、生体内凍結技法(IVCT)および従来の方法(浸漬化学固定-脱水法、切除組織-急速凍結法)を異なるヒト肺癌由来の腫瘍細胞株(Lu65、Lu99、A549)によるヌードマウス腫瘍細胞移植モデルに応用し、HE染色もしくは血管内皮細胞マーカーであるvon Willebrand Factorに対する免疫染色を用いて、比較検討を行った。その結果、以前のEBC-1細胞株で得られた結果と同様に全てのモデル腫瘍において、CbおよびIVCTによって腫瘍細胞組織形態および生きた血行動態下の開存した腫瘍血管が明瞭に観察されることがわかった。また、CbおよびIVCTにより作製された腫瘍組織試料においてアルブミンおよび免疫グロブリンなどの血清蛋白に対する免疫染色を行った結果、それらの蛋白の分布を明瞭に可視化できた。生体内腫瘍組織ではアルブミンやIgGなどの比較的分子量の小さい蛋白は腫瘍間質に広く分布するが、IgMなどの大きな分子量をもつ血清蛋白は血管内に限局して分布することがわかった。CbおよびIVCTにより作製した試料中におけるこのIgMの分布を、尾静脈から注射したウシ血清アルブミン(BSA)の免疫染色像との比較を行った結果、IgMは血管の中でも特に、血流を伴う「機能的血管」に限局して分布することが示された。またBSA注射後に異なる時間が経過後にIVCTにより試料作製を行い、BSAの分布を経時的に検討することで、血管からの血清蛋白の漏出速度が腫瘍内、特に表層部被膜と腫瘍塊深部では大きく異なることを示した。以前から病理組織学的に用いられてきた血管内皮細胞免疫染色による「構造的血管」の評価に対して、CbおよびIVCTとIgM免疫染色では血流を伴う「機能的血管」が可視化できることに注目し、組織切片上でそれらの血管の容積を定量化し、VEGF免疫染色による腫瘍組織内の局所的虚血変化と比較したところ、機能的血管の容積は有意に腫瘍組織の虚血変化と相関することを見出した。これらの結果の一部は現在、複数の原著論文として欧文誌に投稿中である。

研究成果

• [雑誌論文] Distribution of immunoglobulin-producing cells in immunized mouse spleensrevealed with ″in vivo cryotechnique″. (2008)
  • 著者名/発表者名: Saitoh S, Terada N, Ohno N, Ohno S.
  • 雑誌名: J Immunol Methods 331(1-2) ページ: 114-126
  • 査読あり
• [雑誌論文] Recent development of in vivo cryotechnique to cryobiopsy for living animals. (2007)
  • 著者名/発表者名: Ohno N, Terada N, Saitoh S, Zhou H, Fujii Y, Ohno S.
  • 雑誌名: Histol Histopathol 22(11) ページ: 1281-1290
  • 査読あり
• [雑誌論文] Extracellular space in mouse cerebellar cortex revealed by in vivo cryotechnique.(2007)505: 292-301. (2007)
  • 著者名/発表者名: Ohno N, Terada N, Saitoh S, Ohno S.
  • 雑誌名: J Comp Neurol 505(3) ページ: 292-301
  • 査読あり
• [雑誌論文] Involvement of follicular basement membrane and vascular endothelium in blood-follicle barrier formation of mice revealed by ″in vivo cryotechnique″. (2007)
  • 著者名/発表者名: Zhou H, Ohno N, Terada N, Saitoh S, Fujii Y, Ohno S.
  • 雑誌名: Reproduction 134(2) ページ: 307-317
  • 査読あり
• [雑誌論文] Immunohistochemical detection of hypoxia in mouse liver tissues treated with pimonidazole using ″in vivo cryotechnique″. (2007)
  • 著者名/発表者名: Terada N, Ohno N, Saitoh S, Ohno S.
  • 雑誌名: Histochem Cell Biol 128(3) ページ: 253-261
  • 査読あり
• [雑誌論文] Raman microscopy of freeze-dried mouse eyeball-slice in conjunction with the ″in vivo cryotechnique″. (2007)
  • 著者名/発表者名: Terada N, Ohno N, Saitoh S, Fujii Y, Ohguro H, Ohno S.
  • 雑誌名: Microsc Res Tech 70(7) ページ: 634-639
  • 査読あり
• [雑誌論文] Conservation and alteration of chromosome territory arrangements in thyroid carcinoma cell nuclei. (2007)
  • 著者名/発表者名: Murata S, Nakazawa T, OhnoN, Terada N, Iwashina M, Mochizuki K, Kondo T, Nakamura N, Yamane T, Iwasa S, Ohno S, Katoh R.
  • 雑誌名: Thyroid 17(6) ページ: 489-496
  • 査読あり
• [雑誌論文] Interaction of membrane skeletal protein, protein 4. 1B and p55, and sodiem bicarbonate cotransporterl in mouse renal S1-S2 proximal tubules. (2007)
  • 著者名/発表者名: Terada N, Ohno N, Saitoh S, Seki G, Komada M, Suzuki T, Yamakawa H, Soleimani M, Ohno S.
  • 雑誌名: J Histochem Cytochem. 55(12) ページ: 1199-1206
  • 査読あり
• [雑誌論文] Chondrosarcoma with myxoid change: a study using a quick-freezing and deep-etching method. (2007)
  • 著者名/発表者名: Hemmi A, Osaka S, Sumie O, Nemoto N, Ohno N, Terada N, Fujii Y, Ohno S.
  • 雑誌名: Ultrastruct Pathol 31(4) ページ: 293-302
  • 査読あり
• [雑誌論文] Immunohistochemical analyses on serum proteins in nephrons of protein-overload mice by "in vivo cryotechnique". (2007)
  • 著者名/発表者名: Zhou D, Ohno N, Terada N, Li Z, Morita H, Inui K, Yoshimura A, Ohno S.
  • 雑誌名: Histol Histopathol. 22(2) ページ: 137-145
• [雑誌論文] Immunohistochemical detection of phosphorylated rhodopsin in light-exposed retina of living mouse with in vivo cryotechnique. (2006)
  • 著者名/発表者名: Terada N, Ohno N, Ohguro H, Li Z, Ohno S.
  • 雑誌名: J Histochem Cytochem. 54(4) ページ: 479-486
• [雑誌論文] Immunolocalization of serum proteins in living mouse glomeruli under various hemodynamic conditions by "in vivo cryotechnique". (2006)
  • 著者名/発表者名: Li Z, Ohno N, Terada N, Ohno S.
  • 雑誌名: Histochem Cell Biol. 126(3) ページ: 399-406
• [雑誌論文] Histochemical analyses of living mouse liver under different hemodynamic conditions by "in vivo cryotechnique". (2006)
  • 著者名/発表者名: Ohno N, Terada N, Ohno S.
  • 雑誌名: Histochem Cell Biol. 126(3) ページ: 389-398
• [雑誌論文] Expression of protein 4.1G in Schwann cells of the peripheral nervous system. (2006)
  • 著者名/発表者名: Ohno N, Terada N, Yamakawa H, Komada M, Ohara O, Trapp BD, Ohno S.
  • 雑誌名: J Neurosci Res. 84(3) ページ: 568-577
• [雑誌論文] Morphological and histochemical analyses of living mouse livers by new 'cryobiopsy' technique. (2006)
  • 著者名/発表者名: Fujii Y, Ohno N, Li Z, Terada N, Baba T, Ohno S.
  • 雑誌名: J Electron Microsc. 55(2) ページ: 113-122
  • NAID: 10018183523
• [学会発表] クライオバイオプシー法による移植ヒト肺癌腫瘍モデルにおける機能的血管の構築の検討 (2007)
  • 著者名/発表者名: 大野伸彦、寺田信生、白玉勤、齊藤成、藤井靖久、大野伸一.
  • 学会等名: 日本解剖学会 中部地方会
  • 発表場所: 愛知医科大学
  • 年月日: 2007-10-13
• [学会発表] 生体内凍結試料を用いたマウス小脳間質組織の形態計測解析 (2007)
  • 著者名/発表者名: 大野伸彦、寺田信生、斎藤成、大野伸一.
  • 学会等名: 合同学術集会 第48回日本組織細胞化学会総会 第39回日本臨床分子形態学会総会
  • 発表場所: 甲府市総合市民会館
  • 年月日: 2007-09-29
• [学会発表] クライオバイオプシー法によるヒト腫瘍細胞移植マウスモデルの組織学的解析 (2007)
  • 著者名/発表者名: 大野伸彦、寺田信生、斎藤成、藤井靖久、白玉勤、大野伸一.
  • 学会等名: 日本顕微鏡学会
  • 発表場所: 新潟コンベンションセンター
  • 年月日: 2007-05-22