| 研究課題/領域番号 |
18F18765
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| 研究種目 |
特別研究員奨励費
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 外国 |
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| 研究分野 |
生体関連化学
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
井上 豪 大阪大学, 薬学研究科, 教授 (20263204)
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| 研究分担者 |
LI CONG 大阪大学, 薬学研究科(研究院), 外国人特別研究員
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| 研究期間 (年度) |
2018-11-09 – 2021-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2020年度)
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| 配分額 *注記 |
2,200千円 (直接経費: 2,200千円)
2020年度: 500千円 (直接経費: 500千円)
2019年度: 700千円 (直接経費: 700千円)
2018年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
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| キーワード | ストレプトアビジン / 複合体 / Ⅹ線結晶構造解析 / 分子設計 / 精製システム / ペプチド複合体 / タグ |
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| 研究実績の概要 |
ビオチン-ストレプトアビジンは生物界で最も結合定数の高い組み合わせであり、この組み合わせを用いたStrep-tagとして知られている蛋白質の発現・精製システムが開発されている。８つのアミノ酸からなるタグペプチドを認識するストレプトアビジンを担持したビーズで目的タンパク質を高純度に精製することができるシステムである。
しかし、生体内にはビオチンがビタミンとして存在しており、ビタミンが存在する系では精製システムも不活化され、ビーズに担持したストレプトアビジンが機能を失うケースが想定される。そこで本研究では天然型ビオチンに干渉されない新規なタグ精製システムの構築を目指した。
これまでに我々はストレプトアビジンの活性部位の４カ所に変異を加えると天然型ビオチンに全く結合せず、非天然型ビオチンにのみ結合する変異型ストレプトアビジンの作製に成功していたが、そのノウハウを生かし、まず8つのアミノ酸からなるタグペプチドとD27G/L110E、D27G/S112Y、D27G/S112Fの変異体との複合体のⅩ線構造解析を試み、それぞれ1.30、1.43、1.40Å分解能の精度で解析した。ペプチドとの間の結合定数は、4.51×10-7M (S27G), 4.15×10-6 M (S27G/L110E), 2.45×10-6 M（S27G/S112Y）, 1.31×10-6M (V2112 D27A）となり、野生型Wild SAの値6.91×10-7Mの値とほぼ変わらなかった。
得られた構造を基にさらに構造機能相関を検討し、１つの変異体で天然型ビオチンには結合せず、タグペプチドにのみ結合する変異体ストレプトアビジンを作製することに成功した。これによってビタミンとして存在するビオチンに阻害されない新規なタグ精製システムを構築することができた。
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| 現在までの達成度 (段落) |
令和2年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和2年度が最終年度であるため、記入しない。
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