高速AFMによるゲノム編集ツールCRISPR-Casの分子作動機構の網羅的解析

• 研究課題/領域番号: 18H01836
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分28040:ナノバイオサイエンス関連
• 研究機関: 金沢大学
• 研究代表者: 柴田 幹大 金沢大学, ナノ生命科学研究所, 教授 (80631027)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2021-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2020年度)
• 配分額: 17,810千円 (直接経費: 13,700千円、間接経費: 4,110千円); 2020年度: 2,990千円 (直接経費: 2,300千円、間接経費: 690千円); 2019年度: 2,990千円 (直接経費: 2,300千円、間接経費: 690千円); 2018年度: 11,830千円 (直接経費: 9,100千円、間接経費: 2,730千円)
• キーワード: １分子イメージング・ナノ計測 / ゲノム工学 / タンパク質・酵素化学 / １分子計測・操作 / バイオイメージング

研究成果の概要

本研究は、ゲノム編集ツールCasタンパク質群に高速AFMを適用し、様々なCasタンパク質がDNAに結合し切断する瞬間を実時空間で可視化することで、DNA切断分子作動機構を統一的に理解することを目的とした。研究期間において、SaCas９、AsCas12a、LbCas12aに対して高速AFM観察を行い、核酸非結合状態ではフレキシブルな構造をとるが、RNA結合状態では安定で固い構造をとり、RNA-DNA結合状態では、標的DNA配列に強く結合したままであることを明らかにした。この分子動態は、全てのCasタンパク質において観察され、エンドヌクレアーゼにおける共通の分子作動機構といえる。

研究成果の学術的意義や社会的意義

本研究成果における学術的意義として、Casタンパク質におけるRNAの役割が、標的DNA配列へのガイド役だけでなく、立体構造の安定化に寄与することを明らかにした点や、RNA-Casタンパク質がDNA配列へひとたび結合すると、DNA上をスライドすることなく強固に結合したままであることを明らかにした点が挙げられる。また、現代のバイオテクノロジーの中心であるゲノム編集を担うCasタンパク質群のDNA切断分子機構の統一的な理解は、人類にとって重要であり、ゲノム編集技術のさらなく高度化を促す研究成果と位置付けられ、社会的意義は大きいと考えられる。

研究成果

• [雑誌論文] Histone variant H2A.B-H2B dimers are spontaneously exchanged with canonical H2A-H2B in the nucleosome (2021)
  • 著者名/発表者名: Rina Hirano, Yasuhiro Arimura, Tomoya Kujirai, Mikihiro Shibata, Aya Okuda, Ken Morishima, Rintaro Inoue, Masaaki Sugiyama, Hitoshi Kurumizaka
  • 雑誌名: Communications Biology 巻: 4 号: 1 ページ: 1-11
  • DOI: 10.1038/s42003-021-01707-z
  • NAID: 120006960298
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Applicability of Styrene-Maleic Acid Copolymer for Two Microbial Rhodopsins, RxR and HsSRI. (2020)
  • 著者名/発表者名: Tetsuya Ueta, Keiichi Kojima, Tomoya Hino, Mikihiro Shibata, Shingo Nagano, Yuki Sudo*
  • 雑誌名: Biophysical journal 巻: 119 号: 9 ページ: 1760-1770
  • DOI: 10.1016/j.bpj.2020.09.026
  • 査読あり
• [雑誌論文] Macrocyclic peptide-based inhibition and imaging of hepatocyte growth factor. (2019)
  • 著者名/発表者名: Sakai K, Passioura T, Sato H, Ito K, Furuhashi H, Umitsu M, Takagi J, Kato Y, Mukai H, Warashina S, Zouda M, Watanabe Y, Yano S, Shibata M, Suga H, Matsumoto K
  • 雑誌名: Nature Chemical Biology 巻: 15 号: 6 ページ: 598-606
  • DOI: 10.1038/s41589-019-0285-7
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Crystal structure of heliorhodopsin (2019)
  • 著者名/発表者名: W. Shihoya, K. Inoue, M. Singh, M. Konno, S. Hososhima, K. Yamashita, K. Ikeda, A. Higuchi, T. Izume, Okazaki S, Hashimoto M, Mizutori R, Tomida S, Yamauchi Y, Abe-Yoshizumi R, K. Katayama, SP. Tsunoda, M. Shibata, Y. Furutani, A. Pushkarev, O. Béjà, T. Uchihashi, H. Kandori, O. Nureki
  • 雑誌名: Nature 巻: 574 号: 7776 ページ: 132-136
  • DOI: 10.1038/s41586-019-1604-6
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Macrocyclic peptide-based inhibition and imaging of hepatocyte growth factor. (2019)
  • 著者名/発表者名: Katsuya Sakai, Toby Passioura, Hiroki Sato, Kenichiro Ito, Hiroki Furuhashi, Masataka Umitsu, Junichi Takagi, Yukinari Kato, Hidefumi Mukai, Shota Warashina, Maki Zouda, Yasuyoshi Watanabe, Seiji Yano, Mikihiro Shibata, Hiroaki Suga, and Kunio Matsumoto
  • 雑誌名: Nat. Chem. Biol. 巻: 印刷中
  • 査読あり
• [雑誌論文] Oligomeric states of microbial rhodopsins determined by high-speed atomic force microscopy and circular dichroic spectroscopy (2018)
  • 著者名/発表者名: Shibata Mikihiro、Inoue Keiichi、Ikeda Kento、Konno Masae、Singh Manish、Kataoka Chihiro、Abe-Yoshizumi Rei、Kandori Hideki、Uchihashi Takayuki
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 8 号: 1 ページ: 8262-8262
  • DOI: 10.1038/s41598-018-26606-y
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] High thermal stability of oligomeric assemblies of Thermophilic rhodopsin in a lipid environment. (2018)
  • 著者名/発表者名: Tomomi Shionoya, Misao Mizuno, Takashi Tsukamoto, Kento Ikeda, Hayato Seki, Keiichi Kojima, Mikihiro Shibata, Izuru Kawamura, Yuki Sudo, and Yasuhisa Mizutani
  • 雑誌名: J. Phys. Chem. B 巻: 122 号: 27 ページ: 6945-6953
  • DOI: 10.1021/acs.jpcb.8b04894
  • 査読あり
• [学会発表] 高速AFMを用いたCaMKII多量体のCa2+信号積算メカニズムの解明 (2020)
  • 著者名/発表者名: 柴田幹大, 村越秀治
  • 学会等名: 日本生体エネルギー研究会 第46回討論会
• [学会発表] 高速原子間力顕微鏡による柔軟なタンパク質動態のナノスケール撮影 (2020)
  • 著者名/発表者名: 柴田幹大
  • 学会等名: 第43回日本分子生物学会年会
  • 招待講演
• [学会発表] 高速 AFM によるハブ毒液由来脂質分解酵素 PLA2の膜認識機構の解明 (2020)
  • 著者名/発表者名: 神谷孫斗, 柴田幹大, 上田直子, 角野歩
  • 学会等名: 第58回日本生物物理学会年会
• [学会発表] Signal integration mechanism of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II revealed by High-speed AFM. (2020)
  • 著者名/発表者名: Mikihiro Shibata and Hideji Murakoshi
  • 学会等名: BPS2020 64th Annual Meeting
  • 国際学会
• [学会発表] Nano-scale imaging of biological samples using High-speed Atomic Force Microscopy. (2019)
  • 著者名/発表者名: Mikihiro Shibata
  • 学会等名: LIIF2019
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 高速原子間力顕微鏡によるクロマチン動態のナノスケール観察 (2019)
  • 著者名/発表者名: 柴田幹大
  • 学会等名: 第２回クロマチン潜在能領域会議
  • 招待講演
• [学会発表] Visualizing flexibility in protein structures by high-speed atomic force microscopy. (2019)
  • 著者名/発表者名: Mikihiro Shibata
  • 学会等名: 57th日本生物物理学会年会
  • 招待講演
• [学会発表] High-speed atomic force microscopy visualization of protein flexibility in action. (2019)
  • 著者名/発表者名: Mikihiro Shibata
  • 学会等名: Joint UBI-NanoLSI workshop TRENDS IN MOLECULAR BIOPHYSICS OF LIVING CELLS
  • 招待講演
• [学会発表] Physicochemical properties of the microbial rhodopsin RxR in the membrane-mimicking molecule styrene maleic acid (SMA) copolymer. (2019)
  • 著者名/発表者名: Tetsuya Ueta, Keiichi Kojima, Tomoya Hino, Mikihiro Shibata, Shingo Nagano & Yuki Sudo
  • 学会等名: 第11回日本生物物理学会 中国四国支部大会
• [学会発表] Structure and biophysical characterization of the heliorhodopsin. (2019)
  • 著者名/発表者名: W. Shihoya, K. Inoue, M. Singh, M. Konno, S. Hososhima, K. Yamashita, K. Ikeda, A. Higuchi, S. Okazaki, T. Izume, M. Hashimoto, R. Mizutori, S. Tomida, Y. Yamauchi, R. Abe-Yoshizumi, K. Katayama, S. P.Tsunoda, M. Shibata, Y. Furutani, A. Pushkarev, O. Beja, T. Uchihashi, H. Kandori and O. Nureki
  • 学会等名: 57th日本生物物理学会年会
• [学会発表] Application of drift elimination method for high-speed AFM images. (2019)
  • 著者名/発表者名: Shotaro Tsujioka, Hideji Murakoshi, and Mikihiro Shibata
  • 学会等名: 57th日本生物物理学会年会
• [学会発表] Mapping of mechanical property on live cell surface by scanning ion conductance microscope. (2019)
  • 著者名/発表者名: Satoko Kitazawa, Linhao Sun, Ayako Housaka, Takahiro Watanabe-Nakayama, Hiroki Konno, Mikihiro Shibata, and Shinji Watanabe
  • 学会等名: 57th日本生物物理学会年会
• [学会発表] 計測系から見た分子集合体の機能計測-高速AFM計測 (2019)
  • 著者名/発表者名: 柴田幹大
  • 学会等名: 日本化学会第99秋季年会
  • 招待講演
• [学会発表] High-speed atomic force microscopy shows conformational dynamics of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II (2019)
  • 著者名/発表者名: Mikihiro Shibata and Hideji Murakoshi
  • 学会等名: BPS19 63th Annual Meeting
  • 国際学会
• [学会発表] Nanoscale imaging of biomolecules by high-speed atomic force microscopy. (2018)
  • 著者名/発表者名: Mikihiro Shibata
  • 学会等名: International Symposium on Tumor Biology in Kanazawa Joint Symposium
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Watching single proteins in action using high-speed AFM. (2018)
  • 著者名/発表者名: Mikihiro Shibata
  • 学会等名: 56th生物物理学会年会
  • 招待講演
• [学会発表] Filming single proteins at work using high-speed atomic force microscopy. (2018)
  • 著者名/発表者名: Mikihiro Shibata
  • 学会等名: Irago Conference 2018
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] High-speed atomic force microscopy for nano-scale imaging of biological samples. (2018)
  • 著者名/発表者名: Mikihiro Shibata
  • 学会等名: The 2nd NanoLSI Symposium in London -Towards Establishment of New Research Field: Nanoprobe Life Science-
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 高速原子間力顕微鏡による生体分子のナノスケールイメージング (2018)
  • 著者名/発表者名: 柴田幹大
  • 学会等名: 2018日本表面真空学会学術講演会
  • 招待講演
• [学会発表] 高速原子間力顕微鏡による揺らいだタンパク質構造のナノスケール撮影 (2018)
  • 著者名/発表者名: 柴田幹大
  • 学会等名: 非共有結合系の分子科学：計測技術から探る生体分子科学の新展開
  • 招待講演
• [学会発表] Nanoscale visualization of biomolecules using high-speed atomic force microscopy. (2018)
  • 著者名/発表者名: Mikihiro Shibata
  • 学会等名: 6th AIST International Imaging Workshop
  • 招待講演